不同地區(qū)紅色毛癬菌的體外抗真菌藥物敏感性研究

淺部真菌病是人類常見病和常見疾病之一。服用幾種藥物很長時間，很難治愈。本試驗應(yīng)用特比萘芬、酮康唑、萘替芬及聯(lián)合使用酮康唑萘替芬對臨床分離紅色毛癬菌進行了體外藥敏實驗。調(diào)查聯(lián)合應(yīng)用抗真菌藥物的效果,同時探討可能影響藥物敏感性的因素。1材料和方法1.1手、足充血藥檢測165株臨床分離紅色毛癬菌菌株采集于門診皮膚科患者的體、股癬及手、足癬標(biāo)本,其中北京協(xié)和醫(yī)院41株、南京皮膚病研究所81株、上海長征醫(yī)院及上海長海醫(yī)院43株,經(jīng)常規(guī)鏡檢、生理生化和API20CAUX鑒定。質(zhì)控菌株選用近平滑念珠菌ATCC22019。1.2外加劑用量milipore-m1640培養(yǎng)基含BPMI-1640粉10.4g/L(LifeTechnologiesInc),三氦嗎啡啉丙磺酸(MOPs,Fluka)34.53g/L以1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0(25℃),用Millipore濾過滅菌(濾膜0.22μm)。改良沙氏固體培養(yǎng)基(SDA)葡萄糖2%,蛋白胨1%,瓊脂2%,加氯霉素0.05mg/ml,115℃高壓蒸汽消毒20min,分裝平皿和試管,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3藥物的配制及倍比稀釋藥物分別為酮康唑、萘替芬及特比萘芬,由重慶華邦制藥有限公司提供原藥,含量為99.9%,符合《中國藥典》2000年版的質(zhì)量要求。實驗共分為4組:酮康唑組、萘替芬組、特比萘芬組及聯(lián)合用藥組。聯(lián)合用藥組藥物由酮康唑及萘替芬按比例混合。依據(jù)M38-A方案配制上述藥物的貯存液。酮康唑的濃度為128μg/ml,萘替芬、特比萘芬及聯(lián)合用藥的濃度為1μg/ml。藥物的倍比稀釋:按照M38-A方案,用1640培養(yǎng)基做10級倍比稀釋。無菌條件下,在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)各加入100μl培養(yǎng)基,以8頭移液器吸取100μl藥液,加入第1孔,充分混合后吸取100μl混合液加入第2孔,依次類推,加至第10孔后吸取100μl棄去。第11、12孔為生長和空白對照孔。1.4各菌株的培養(yǎng)將受試菌株接種于改良沙氏固體培養(yǎng)基(SDA)上35℃培養(yǎng)5～10d充分活化后,加入1ml的生理鹽水,巴氏吸管輕輕抽吸,將有孢子和菌絲片斷的菌懸液置于無菌試管中,倒入研磨器研磨均勻后經(jīng)血細胞計數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度至5×106CFU/ml。然后用RPMI1640培養(yǎng)液將菌絲懸液稀釋為5×104CFU/ml,兩倍于終濃度。各種藥物組的96孔板中,除第12孔為空白對照外,其余各孔加入各菌株菌絲懸液100μl。35℃下培養(yǎng)5d后觀察結(jié)果。此時菌絲終濃度為2.5×104CFU/ml,藥物終濃度:酮康唑為0.063～32μg/ml,萘替芬、特比萘芬及聯(lián)合用藥組為0.0005～0.25μg/ml。1.5嚴(yán)格控制mic值A(chǔ)TCC22019為參考菌株,其酮康唑MIC參考值為0.06～0.25μg/ml,每次試驗以此株菌為參照,當(dāng)MIC值位于該范圍,認(rèn)為試驗操作準(zhǔn)確有效。同時設(shè)立空白和生長對照。1.6按mic值的終點于培養(yǎng)5d后觀察受試菌株結(jié)果。用視覺法判定終點,按M38-A方案要求以80%生長抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC值。在自然光線下由多人同時判定結(jié)果,以保證結(jié)果的穩(wěn)定性。1.7最低抑菌濃度計算抑菌濃度指數(shù)(FractionalInhibitoryIndex,FICI),即聯(lián)合用藥時各藥的最低抑菌濃度分別除以各藥單用時MIC值的商之和。FICI≤0.5時為協(xié)同作用,0.5<FICI≤1時為相加作用,1<FICI≤2時為無關(guān)作用,FICI>2時為拮抗作用。1.8sng-q檢驗將各藥單用及聯(lián)用時的兩組MIC值轉(zhuǎn)換為對數(shù)后進行SNK-q檢驗,P<0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。對比北京、南京、上海三地紅色毛癬菌的MIC值差異采用秩和檢驗,P<0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。2聯(lián)合用藥對菌株mic值的影響2.14組抗真菌藥物對3地紅色毛癬菌藥敏試驗的MIC值幾何均數(shù)結(jié)果見表1。各藥物組的MIC值轉(zhuǎn)換為對數(shù)后經(jīng)SNK-q檢驗,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組MIC值小于單用酮康唑、萘替芬組(P<0.05),聯(lián)合用藥組與特比萘芬組的MIC值之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。聯(lián)合用藥在95%的菌株上表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用,見表2。2.2各地區(qū)紅色毛癬菌對各藥物組的MIC值的秩和結(jié)果見表3,對以上結(jié)果進行FriedmanM秩和檢驗并經(jīng)q檢驗的結(jié)果見表4。結(jié)果顯示在采集于北京的菌株對藥物的敏感性除了在特比萘芬組外都普遍低于上海的菌株,除了酮康唑組外都明顯低于南京的菌株,而上海同南京的菌株在對藥物的敏感性方面沒有顯著差異。3抗真菌聯(lián)合用藥試驗結(jié)果淺部真菌感染是皮膚科的常見疾病,紅色毛癬菌是主要的致病真菌之一。外用抗真菌藥物相對安全、廉價、方便,是治療淺部真菌病的首選,但由于患者依從性等問題,單用某種藥物治療往往耗時長,難治愈。聯(lián)合用藥可以提高療效,縮短治療時間,提高治愈率。此外,不同地區(qū)的真菌對藥物的敏感程度是否類似,以往并無這方面的研究,是否應(yīng)該對不同地區(qū)的患者采取不同的用藥濃度及治療時間并無理論依據(jù)。酮康唑的作用機理是抑制羊毛固醇14-α脫甲基轉(zhuǎn)化為麥角固醇,抑制了真菌細胞膜的形成;萘替芬通過抑制角鯊烯環(huán)氧化酶阻斷角鯊烯轉(zhuǎn)化為麥角固醇,同時使角鯊烯堆積使菌壁破裂,理論上聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為協(xié)同作用。本試驗結(jié)果顯示,酮康唑、萘替芬聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于酮康唑、萘替芬單用(P<0.05),與特比萘芬單用效果相似(P>0.05),并證實了聯(lián)合應(yīng)用對紅色毛癬菌具有協(xié)同或相加作用,療效優(yōu)于單一藥物。以往的研究也發(fā)現(xiàn)在酵母菌體外實驗中,聯(lián)合用藥可以顯著降低兩種藥物的MIC值的幾何均數(shù),顯示出協(xié)同或相加作用。另外,在對絲狀真菌的體外藥物敏感性研究中,也有類似發(fā)現(xiàn)。本研究中發(fā)現(xiàn)在紅色毛癬菌中也存在類似的協(xié)同和相加作用。這些研究提示我們,隨著臨床上抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用,各種真菌對于抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,聯(lián)合用藥可能成為抗真菌治療的手段之一。本實驗為臨床聯(lián)合應(yīng)用抗真菌藥物治療淺部真菌病提供了體外試驗依據(jù)。在本試驗中,我們觀察到在各藥物組中,采集于南京及上海的菌株對藥物的敏感度相似,而采集于北京的菌株對藥物的敏感性低于南京及上海的菌株,除在一組藥物中差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,其他組均有顯著差異。2004年的一項研究顯示,柬埔寨的110株新生隱球菌菌株對氟康唑和伏立康唑的敏感性要低于非洲的52株菌株,雖然它們對兩性霉素B都很敏感。在細菌中也發(fā)現(xiàn)存在類似情況,研究顯示采集于非洲、歐洲、美洲的霍亂弧菌對利福昔明和四環(huán)素的藥物敏感度各不相同。由此可見,不同地域中的微生物對藥物敏感度存在差異可能是一種普遍現(xiàn)象。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是多樣化的,可能有