醫學檢驗中應用的核酸檢測技術

現在，人類疾病與疾病直接或間接關系。原子能成像和分析在遺傳疾病、腫瘤和傳染性疾病等領域的應用越來越廣泛。這為疾病的診斷和治療提供了新思路，并與疾病有關的疾病的發病機制有關。醫學實驗室所要檢測和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA)以及反映基因轉錄水平的mRNA,也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA或RNA)。現介紹醫學檢驗中應用的核酸檢測技術及其進展。一、樣品的制備1.細胞勻漿和dna純化常用材料多為人白細胞或組織細胞,前者取EDTA-Na2抗凝全血用NH4Cl或雙蒸水作低滲溶血處理,洗滌后即可得,因肝素會抑制限制性內切酶和DNA多聚酶的活性,故血液抗凝劑一般不用肝素,組織細胞則須先用勻漿器在冰浴中研磨成細胞勻漿。上述經預處理的細胞經十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶K作用消化分解蛋白質,繼用一定比例的酚、氯仿、異戊醇抽提液將蛋白質除去,所得的DNA溶液用乙醇沉淀或透析等方法進一步純化,現已有多種商品化的DNA分離試劑盒供應。DNA純度和含量的測定用比色法,在紫外分光光度計上測定A230nm、A260nm和A280nm值,DNA(雙鏈)含量為A280nm值×50μg/ml×比色時的稀釋倍數,A260nm/A280nm比值>1.7示純度較高,A260nm/A280nm比值>2.0表明含酚等雜質少。2.rna的提取RNA的檢測、序列分析、cDNA文庫的構建以及蛋白質的體外翻譯等均要求RNA保持完整性并達到一定的純度。由于RNA酶(RNase)廣泛存在(如汗液、氣霧及受檢細胞內)且十分穩定不易失活,內源性和外源性的RNA酶是影響RNA完整性的最大威脅,因此,所有用于RNA提取的工作面、器械、容器、溶液和及用于預電泳的電泳槽等必須經特殊的物理或化學處理,以去除RNA酶的污染;為避免細胞組織在保存過程中RNA的自身降解,取樣應新鮮,短期貯存可置-70℃,長期則須置液氮速凍;在RNA提取過程中應規范操作,抑制RNA酶的活性和嚴格防止污染,常用的RNA酶抑制劑有焦碳酸二乙酯(DEPC)、異硫氰酸胍和RNasin,近年來有商品化的RNaseZAP(一種能去除各種容器表面RNA酶污染的噴霧型制劑)和RNaseSecure(用于去除溶液RNA酶污染的制劑)供應,使處理過程大為簡化。RNA的提取以往多用異硫氰酸胍法,現國外已推出TRIzol提取試劑盒,簡便快捷且得率高。mRNA是基因轉錄的產物,在研究基因表達水平時常要求得到較純的mRNA,利用成熟的mRNA3’端均含有多聚腺嘌呤核苷酸(Poly-A)的特點,可將RNA上寡聚脫氧胸苷酸(Oligo-dT)纖維素柱,在不同的鹽濃度下mRNA與該柱的結合能力不同,mRNA藉高鹽條件特異性地結合于柱上,繼降低鹽濃度使mRNA被洗脫下來,一般經2次過柱可得到較高純度的mRNA。二、核酸探針aa的制備方法與標記物該技術是建立最早、最基本核酸檢測技術,核酸分子雜交是指具有一定互補序列的核酸(RNA或DNA)單鏈在液相或固相體系中按堿基配對原則締合成異質雙鏈的過程,應用該技術可對特定DNA或RNA分子進行定性或定量的檢測。該技術的關鍵工具是探針,即人工制備的與待測核酸分子互補、標有不同標記物的單鏈DNA或RNA。核酸探針按其來源不同可分為通過克隆技術從基因文庫中篩選的基因組探針、從RNA逆轉錄獲得的cDNA探針和人工合成的寡核苷酸探針。標記物最早采用放射性核素,后有生物素、地高辛、熒光素,近年來又發展出N-醋酸-2-乙酰氨基(AFF)修飾的探針和磺化半抗原探針等,可按需要和條件選用。核酸分子雜交反應受離子強度、pH值、溫度、時間、探針種類、大小及濃度的影響,需根據各自的條件摸索確定。核酸分子雜交常用的方法有以下幾種。1.待檢核酸片段的國中身份鑒別利用硝酸纖維膜具有吸附單鏈DNA和RNA的特性,可將DNA樣品直接點在纖維素膜上,或用帶狹槽的裝置將待檢RNA點成狹線,經變性、固定后先經鮭精DNA預雜交,以降低背景和非特異性信號,再加探針雜交,最后根據探針的標記物不同,用放射自顯影、鏈霉親和素酶結合物或抗地高辛抗體酶結合物顯色等判斷待檢核酸片段中是否存在與探針同源的序列,方法簡便易行,可作定性或半定量分析。2.實驗4標記物互補結合顯色法將特異性探針包被在微孔板上,與待檢物互補結合,繼加可與待檢物結合的標記物,經顯色后判斷靶序列存在與否(見本文三、PCR-雜交酶聯技術)。3.dna片段轉移經限制性內切酶酶解的DNA片段經電泳分離后按相對分子質量大小排列在瓊脂糖凝膠上,由于凝膠的機械強度不高,在雜交過程中易斷裂,膠內的DNA片段也會隨著時間的推移逐漸擴散丟失,為解決這一問題,Southern利用高鹽溶液的上吸作用,將變性后的片段按原區帶位置轉移到硝酸纖維膜上,繼經預雜交、雜交顯示結果。吸印轉移的方法還有電轉移和真空轉移等。4.利用甲醛/瓊脂糖凝膠變性電泳分離用于RNA的檢測分析,單鏈RNA先用甲醛/瓊脂糖凝膠變性電泳分離,繼按相同的原理將其轉移到硝酸纖維膜上,再進行雜交、預雜交顯示結果。5.原位雜交和調整用標記的DNA或RNA為探針,在組織或細胞原位進行核酸分子雜交以顯示組織細胞內某一部位特定的核酸片段,其優點是可以對特定核酸片段進行組織細胞的定位。用于原位雜交的玻片需經去除核酸酶、包被粘附劑等預處理,以防止細胞內RNA的降解及細胞脫落,國外已有專供原位雜交用的商品化玻片供應。原位雜交分直接法和間接法兩類,前者是將各種標記物標記在探針上,如熒光原位雜交技術(FluorescenceinSituHybrization,FISH)已有不少商品化的試劑問世,但直接標記的探針經過雜交,標記物穩定性有所下降;后者則是用半抗原標記探針,繼通過免疫組織化學法對半抗原定位,間接顯示探針與靶核酸形成的雜交體,后者的穩定性和通用性較強。三、標準和制度不完善1985年問世的PCR,是模擬DNA體內復制過程、將目的基因在體外擴增的技術,其特異性和靈敏度俱佳,我國于80年代末引進并用于臨床,當時多以PCR產物電泳后特定堿基對(bp)條帶的有無作為定性結果的判斷依據,在產物的分析方法、實驗室設置、防污染操作規范、人員培訓和試劑質量等方面無統一的標準,管理制度亦欠完善。為使PCR技術的優勢得到充分體現,有必要按國際慣例結合國情建立一整套管理制度,包括按標準建立專用實驗室,對操作人員進行正規培訓,嚴格遵循操作規范,實行全過程質控,試劑中引入防污染系統,擴增產物的分析采用雜交、限制性片段長度多態性等取代可能影響結果準確性的電泳法,試劑須經國家藥品生物制品檢定所(SDA)檢定合格方可用于臨床等。1.反應混合物配制和擴增區臨床PCR實驗室應設獨立相隔的四區:(1)試劑貯存和準備區;(2)標本準備區;(3)反應混合物配制和擴增區;(4)擴增產物分析區。如采用擴增和產物檢測同時完成的熒光定量PCR或全自動分析儀則可將(3)、(4)兩區合并。上述各區應分別按該區的標準配置專用的儀器、工具和各種用品。臨床PCR實驗室應經主管部門驗收認可。2.pcr擴增植酸鹽的處理PCR實驗的污染主要來自經成百萬倍擴增的產物,同時也不可小視來自天然基因組、試劑以及標本間氣溶膠擴散導致的污染。擴增的產物污染引致的PCR假陽性可用UNG/dUTP系統有效去除,具體過程為:擴增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP),故產物中含尿嘧啶核苷(dU),后續擴增之前,在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG),在預變性加熱時,若體系中存在前一次擴增產物的污染,污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂,不可能作為下一次擴增的模板,從而達到消除污染的目的。此外,長波紫外線的持續照射,通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物也有可靠的效果。其他的去污染措施如次氯酸鈉清潔工作面、實驗工具和消耗品如加樣器、反應管、吸樣頭的高壓處理也必不可少。現有帶濾芯的加樣器塑料頭問世,可預防加樣器污染。3.混和液pcr這是PCR試驗成功的前提和基礎,如工作人員進入各工作區必須嚴格按1區→4區的方向,不得逆行;各區的工作服、工作鞋、消耗品、辦公用品、剩余的試劑不允許移至他區使用,一次性的塑料用品用后須浸入專門的消毒液中;加樣、打開裝有反應混和液或擴增產物的反應管均應在通風柜中進行,并特別小心,及時閉蓋,尤其是巢式PCR;若有溶液濺出必須及時記錄;用微孔板雜交時應使用洗板機洗板等。4.pcr擴增過程及酶催化酶系統質控必須對核酸分析的各步驟進行質量控制,以避免假陽性和假陰性,在實驗材料的準備、PCR實驗的每一步驟以及擴增反應前后的酶反應各步均應有質控。所有開展臨床基因擴增檢測的實驗室都應參加室間質量評價,并作為開展該項檢測的條件和依據之一。5.經國家藥物管理局sda批準，用于臨床核電廠檢測的認可(1)pcr-雜交酶聯定量方法將PCR與雜交、酶聯技術結合,反應在微孔板上進行。現國內應用的主要有3類,第1類是將與靶片段一段互補的DNA片段固定在微孔板上作為捕獲探針,加入PCR產物后再加入酶標記的與PCR產物另一段互補的探針,經底物顯色判斷結果,稱為“夾心雜交”;第2類是將生物素標記PCR2條引物的5’端,經PCR后,產物均結合有生物素,微孔板上包被有捕獲探針,將PCR產物與捕獲探針結合,繼加能與生物素特異牢固結合的、標有過氧化物酶的鏈霉親和素,最后加底物顯色判斷結果,本法引入內對照系統后可進行定量測定,即設計引物序列與模板相同但探針序列與模板不同的核酸片段作為內對照,將已知拷貝量的內對照與待檢樣品在同一反應管內擴增,對PCR效率進行校正,依據內對照分子擴增前后的比值與待檢樣品中靶分子擴增前后比值相等的原理,可推知受檢樣品中特定DNA片段的起始拷貝量,PCR-雜交酶聯定量方法現已用于臨床檢測病毒載量;第3類反向雜交梳法,其原理是按酶標微孔板的孔間距大小制成由吸水材料和硝酸纖維膜(NC)兩層組成的雜交梳,硝酸纖維膜上點有與靶序列互補的探針,在引物之一的5’端標上生物素,將待檢物按PCR常規擴增的產物變性后加入微孔中,插入雜交梳,靶片段藉毛細作用與NC上的探針結合,雜交梳逐孔與鏈霉親和素-酶結合物、底物作用,據探針部位是否顯色判斷定性結果。檢測乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、結核分枝桿菌(TB)和沙眼衣原體(CT)等病原微生物的PCR-酶聯國產試劑已獲SDA批準用于臨床。本法對儀器設備的要求不高,易普及。(2)熒光光譜分析和定量pcr1995年由美國PE公司發明的FQ-PCR技術,是在普通的PCR系統中,加入一個與靶片段序列互補的雙熒光標記探針,該探針的5’端標記熒光報告基團,3’端標記熒光淬滅基團,當探針完整時,由于淬滅基團的作用,報告基團不能產生熒光,當有靶片段存在時,標記探針與之結合,在PCR過程中,當引物延伸至標記探針結合部位時,由于DNA聚合酶具有5’-3’的核酸外切酶活性,遂將探針5’端的熒光報告基團切下,同時實現鏈替換,由于報告基團脫離了探針,淬滅基團對其的淬滅作用解除,報告基團即可發出熒光信號,其強弱隨PCR擴增進程不斷加強,并與PCR產物的數量成正比,經特定的熒光光譜分析儀測得熒光強度,可實時動態定量觀察PCR擴增的對數期、線性期和平臺期的變化,與標準陽性定量梯度樣品的標準曲線比較,可推算出待檢物的起始拷貝量。FQ-PCR不僅可以準確定量,而且由于線性范圍寬(0~1011拷貝/ml),樣品無需稀釋;儀器測定熒光信號的靈敏度大大高于肉眼對電泳條帶的觀察;在FQ-PCR反應中有熒光探針參與雜交,以熒光強度報告結果,因而無需對PCR產物進行電泳、雜交等后處理,除加樣時一次開管外,全過程閉管操作,FQ-PCR這一最大優點,能有效克服擴增產物污染造成的假陽性,特異性相應提高。FQ-PCR適用于各種病原體的定性和定量檢測,其中病毒載量定量測定已用于療效考核、治療方案制定和預后評估等,此外,在遺傳病的突變檢測、癌基因和抑癌基因結構或表達異常的檢測、與疾病相關的各種蛋白(如各種受體、細胞因子、腫瘤標志物、酶、激素)的基因表達水平(mRNA)的定量檢測等領域,FQ-PCR均顯示了其廣闊的應用前景。FQ-PCR檢測HBV、HCV、CT、TB試劑已經SDA批準作為臨床檢驗用試劑。6.基于pcr的模擬技術按分析擴增產物所采用的方法或引物設計原則不同,常規PCR衍生出多種方法,在核酸的研究和臨床檢測中應用日漸增多,以下作簡要介紹。(1)自動化分析的啟動從Sanger創立的雙脫氧核苷酸鏈終止法起,隨著方法和標記物的改變,測序已進入自動化分析的階段。測序是研究未知基因最直接的方法,對設備和技術要求較高;(2)基因序列測定限制性核酸內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶,人群中個體間基因的核苷酸序列存在差異,稱為DNA多態性,它可使特定限制酶切片段的大小和數目發生變化,稱為RFLP,可藉此發現點突變,分析不同的基因型,用RFLP作為遺傳標記,可判斷遺傳病先證者親屬和胎兒是否帶有該病的致病基因。(3)提高染料熒光強度采用可與雙鏈DNA特異性結合的染料SYBR-GreenI,隨著PCR過程中產物雙鏈DNA的量呈指數式增加,該染料的熒光強度亦成比例增強,可借助儀器動態監測PCR產物的量。(4)設計知識產權引物常用于分析不同的基因型,在設計PCR引物時,選取序列相同區域的DNA片段為公共引物,可在該引物的3’端引入一故意錯配的堿基,另設計針對不同等位基因特定序列的若干特異性寡核苷酸引物,當攜帶某一等位基因的模板DNA與相應的等位基因特異性寡核苷酸引物及公共引物反應時,擴增出相應的基因片段,由此確定不同的等位基因。(5)雙鏈突變電泳單鏈DNA具有序列特異性的二級結構,相同長度的單鏈DNA因序列的差異甚至單個堿基的改變都可影響二級結構(空間構象),可用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別,檢測雙鏈突變可先將雙鏈DNA變性再進行電泳,依據野生型(正常)DNA和待檢樣品間電泳時遷移能力的差異造成的泳動變位判斷是否存在堿基的差異。SSCP廣泛用于突變篩選。(6)pcr-等位基因特異性遺酚酸aso的檢測分析對等位基因結構異常已知的疾病,將PCR產物與針對特定等位基因的寡核苷酸探針雜交,可確診受檢者是否帶有致病基因及雜合狀態。(7)pcr序列獨特的闊果酸sr的檢測分析對基因突變位點已知的異常,可擴增含突變位點的DNA片段,繼用序列不同的寡核苷酸探針與產物雜交,根據雜交結果判斷受檢基因的序列。(8)突變位點引物篩選設計一條正鏈引物(S)和分別針對正常和突變位點的負鏈引物1、2,待檢物分別用兩對引物(S、1和S、2)擴增,據擴增產物的有無判斷是否存在突變以及雜合狀態。(9)基于聚丙烯酰胺凝膠電泳的dna用于比較mRNA表達的相對差異,先將總RNA逆轉錄為cDNA,繼用一套隨機引物擴增該cDNA,產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后,根據泳道上顯示的相同長度(可從150bp~2kb)的片段的強度不同判斷轉錄產物的差異。(10)儀器兩端的連接PCR產物在毛細管電泳儀上分析,該儀器的兩極由一根內徑為20~200μm的毛細管連接,適宜在高電場下運行,速度快,分辨率高,重復性好。(11)r-高效液體層析成像hplc用高效液相對PCR產物作鑒定,結果準確。但本法和PCR-毛細管電泳法對儀器和操作要求較高,均不適于臨床檢測。(12)低溫退火條件下dnapcr檢測引物設計無需特異的核苷酸序列信息,而是以1條單一的、由10個左右堿基組成的隨機核苷酸序列的DNA片段為引物,在低溫退火條件下對樣品基因組DNA進行PCR擴增,該引物在一個或多個位點與基因組DNA結合,可使未知區域擴增獲得廣泛的DNA多態信息。常用以制備探針、構建基因文庫和基因圖譜分析,在分析微生物菌株間的親緣關系和生物系統發生研究中應用較多。(13)微衛星dna的重復單位數目的不穩定性以及與其他疾病的基微衛星是指在人基因組中以1~6bp為單位、重復出現10~60次的DNA序列,由于微衛星區域在人基因組中出現的數目和頻率不同而表現出多態性,當這種多態性序列與某一致病基因位點連鎖時,可將其作為遺傳標記,進行遺傳缺陷的產前診斷、雜合子的鑒定及親子鑒定等,因其具有雜合性高、高度多態、突變率低的特點,比以往所用的遺傳標記應用價值更大,微衛星DNA重復單位數目的不穩定性與一些遺傳性疾病相關,在一些腫瘤中發現微衛星DNA重復單位數目改變和從2bp至大片段的缺失和擴增。檢測方法是對特定區域DNA作PCR擴增,藉產物的高分辨電泳來鑒別和分析。四、dna芯片的臨床應用前景和局限性DNA芯片是將預先設計好的幾百乃至數十萬個寡核苷酸或cDNA(已知基因或帶有可能突變位點的序列)有序而密集(點間距離一般<500μm)地排列在玻璃片(珠)、硅片、尼龍膜、塑料片(珠)等固相支持物上制成的微矩陣(microarray),在檢測時以此作為探針,將待測樣品用同位素或熒光標記后與芯片上的探針進行雜交,通過放射自顯影或激光共聚焦顯微鏡掃描后,用計算機軟件對雜交結果進行分析,獲得雜交信號的強度和分布模式圖,根據雜交信號所在位置探針的序列特點、衰變速率和信號強弱,獲取樣品分子的數量和序列信息。應用這一技術可對基因數量、序列和表達功能進行大規模、高通量、快速高效的研究,較傳統的核酸印跡雜交操作簡便、自動化程度高,為人類后基因組計劃提供了理想的研究手段,并設計了適合臨床檢驗的菜單式芯片系統,使每張芯片可檢測多份樣品。現國內已有適用于臨床檢驗DNA芯片機和配套試劑問世,在腫瘤相關基因點突變、缺失、插入、融合的研究、遺傳性疾病、單核苷酸多態性的分析、病原體及其變異的檢測中取得了初步的結果。但如特異性和敏感性有待提高,樣品制備和標記過程的簡化、儀器的研制和機械化自動化程度的提高,降低成本等。若能解決這些問題,DNA芯片的臨床應用前景將十分廣闊。附件:近年來核酸分析和擴增技術頗快進展,現選摘如下,供有興趣的讀者參閱。1.核酸酶保護分析(RNaseprotectionassay)將單鏈DNA探針與待檢RNA雜交,由于核酸酶S1專一降解單鏈核酸,故雜交后形成雙鏈的部分可受保護不被降解,未形成雙鏈的DNA或RNA單鏈則被S1酶降解成核苷酸,通過變性聚丙烯酰胺電泳分離,放射自顯影和光密度掃描可檢測RNA的長度和含量。2.轉錄介導的擴增(TranscriptionMediatedAmplifi