飼料中木聚糖酶的檢測方法研究

木聚糖是植物半養(yǎng)分的主要成分，是自然界中含量豐富的可再生資源。木聚糖是飼料中含量較高的抗?fàn)I養(yǎng)因子,不能被動(dòng)物消化道所吸收,并且阻礙其他營養(yǎng)成分的消化利用,因此,飼料中常添加一定量的木聚糖酶來消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用,提高動(dòng)物對飼料的利用率。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子中β-1,4木糖苷鍵的酶系,可將木聚糖水解為低聚木糖、木寡糖、木二糖以及少量阿拉伯糖和木糖的一種復(fù)合酶系統(tǒng);不僅應(yīng)用于飼料中,還廣泛應(yīng)用于生物能源、食品、制藥、制漿、造紙、紡織等行業(yè)。目前檢測木聚糖酶的常用方法為二硝基水楊酸(DNS)法,此法雖然簡便快捷,但靈敏度較低,難以滿足飼料中微量木聚糖酶的檢測需求。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于檢測酚類和醛類化合物,還可與含羰基的化合物反應(yīng)。因此,張永勤等已將其用于木聚糖酶的檢測,該法靈敏度高,理論上可用于飼料中微量木聚糖酶活性的測定。但實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn),由于飼料中存在多種酚類、醛類等還原性物質(zhì),均會(huì)與MBTH發(fā)生反應(yīng),其反應(yīng)靈敏度又高,使得樣品空白的本底顏色過深從而影響測定,最終導(dǎo)致MBTH法的測定效果大打折扣,相對于DNS法并沒有明顯優(yōu)勢。本文采用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法對飼料提取液中的木聚糖酶和小分子還原性物質(zhì)進(jìn)行分離,富集木聚糖酶的同時(shí)盡量減少其中還原性物質(zhì)的量,避免對檢測造成干擾,再采用MBTH法測定其木聚糖酶的活性,充分發(fā)揮MBTH法高靈敏度的優(yōu)勢,達(dá)到較理想的效果。1材料和方法1.1木聚糖酶及飼料木糖,木聚糖,3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH),二硫蘇糖醇(DTT),硫酸鐵銨,氨基磺酸,乙酸,乙酸鈉,氫氧化鈉等。木聚糖酶及飼料樣品均采購于市場。透析袋(截留分子量8耀14ku),超濾離心管(millipore,AmiconUltra15,截留分子量10ku),紫外-可見分光光度計(jì)(UnicoUV2800),水浴振蕩器,漩渦混合器,電子天平(萬分之一),恒溫水浴鍋,中藥粉碎機(jī),移液器,秒表等。1.2木聚糖酶活性測定1)待測液的提取。飼料樣品按GB/T14699.1的規(guī)定進(jìn)行采樣后,取適量以四分法縮分至200g左右,再粉碎并通過0.45mm標(biāo)準(zhǔn)篩,混勻后裝入密封容器內(nèi)待用。取2g待測樣品于150mL錐形瓶中,加入50mmol/L的乙酸緩沖液100mL(pH值5.5),在25℃的水浴振蕩器上以150r/min提取30min,再取適量溶液以4000r/min離心10min后取上清液待測。2)透析法處理。取25mL待測液于處理好的透析袋內(nèi)(截留分子量8~14ku),密封后置于250mL乙酸緩沖液(pH值5.5)中進(jìn)行透析,在25℃的水浴振蕩器中透析2h后,收集透析袋內(nèi)的待測液并定容至50mL,最后用MBTH法對其中的木聚糖酶活性進(jìn)行分析。3)超濾法處理。取12.5mL待測液于處理好的超濾離心管中(截留分子量10ku),4000r/min離心20min后收集上層濃縮液并定容至25mL,再用MBTH法對其中的木聚糖酶活性進(jìn)行分析。4)試劑的配制。MBTH顯色液:3mg/mL的MBTH溶液和1mg/mL的DTT溶液等量混合即得,現(xiàn)用現(xiàn)配,1d內(nèi)有效。硫酸鐵銨試劑:準(zhǔn)確稱量5.00g硫酸鐵銨和5.00g氨基磺酸,溶解,轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中,加入36%~38%的濃鹽酸41.75mL,溶解,定容至刻度,充分混勻,轉(zhuǎn)移至棕色瓶中,于4℃冰箱貯藏待用。木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取干燥至恒質(zhì)量的木糖0.1001g,用緩沖液定容至100mL,得1mg/mL的木糖溶液。5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和2.8mL,用乙酸緩沖液定容至100mL,配制成濃度為4、8、12、16、20、24和28滋g/mL的木糖溶液。分別取上述各濃度木糖溶液500滋L(設(shè)3組平行樣),加入到500滋L0.5mol/L的NaOH溶液中,再分別加入MBTH試劑500滋L,充分混勻,80益水浴加熱15min后,迅速加入硫酸鐵銨試劑1mL,室溫冷卻后在650nm處測定吸光度值。以相應(yīng)緩沖溶液代替木糖溶液制成空白樣。以木糖濃度為Y軸,吸光度值為X軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6)木聚糖酶活性的測定。取預(yù)處理后的待測液0.5mL,經(jīng)37益預(yù)熱5min后與0.5mL木聚糖底物溶液(0.8mg/mL)于試管中混勻,于37益反應(yīng)30min,加入0.5mol/L的NaOH溶液1mL,充分混合以終止反應(yīng);再分別加入MBTH試劑1mL,充分混勻,80益水浴加熱15min后,迅速加入硫酸鐵銨試劑2mL,室溫冷卻后在650nm處測定吸光度值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木糖的生成量。而空白對照則是先在待測液中加入NaOH溶液使其中的木聚糖酶變性失活,再加入木聚糖底物溶液并進(jìn)行后續(xù)的顯色反應(yīng)。7)酶活計(jì)算公式。:木聚糖酶活性(U/g);E:酶反應(yīng)液吸光度值;B:空白對照吸光度值;:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;:樣品的稀釋倍數(shù);:樣品質(zhì)量/g;:反應(yīng)時(shí)間/min;M:木糖的摩爾質(zhì)量,150.1g/mol。1.3回收率和精密度1)準(zhǔn)確度的驗(yàn)證。精確添加一定量的木聚糖酶至空白飼料樣品(未添加木聚糖酶)中,檢測其木聚糖酶的含量,通過與理論添加量的比較來考察方法的回收率。2)精密度的驗(yàn)證。分別比較1d之內(nèi)檢測3次和連續(xù)檢測3d結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),來考察方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。2結(jié)果與分析2.1酶活性計(jì)算MBTH法測木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為,檢測樣品酶活時(shí)將各數(shù)據(jù)代入酶活的計(jì)算公式即可。2.2木聚糖酶的分離和超濾法取不同公司的飼料樣品A、B、C、D、E共5份,分別采用透析法和超濾法進(jìn)行預(yù)處理,對照則不采用任何預(yù)處理方法,提取待測液后直接用MBTH法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表1所示。由表1可明顯看出,樣品經(jīng)透析法或超濾法進(jìn)行預(yù)處理后,空白對照吸光度值會(huì)大幅下降,如:樣品A的空白對照吸光度值為0.779,經(jīng)過透析法預(yù)處理后降為0.366,經(jīng)過超濾法預(yù)處理后降為0.347;樣品B的空白對照吸光度值為0.865,經(jīng)過透析法預(yù)處理后降為0.406,經(jīng)過超濾法預(yù)處理后降為0.392…說明透析法和超濾法都能達(dá)到對飼料樣品提取液中的木聚糖酶進(jìn)行分離和富集的目的。透析是通過小分子(關(guān)鍵是會(huì)對檢測造成干擾的還原性物質(zhì))會(huì)經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到緩沖液中,而生物大分子(包括木聚糖酶)則會(huì)被保留在透析袋內(nèi)的原理,將小分子雜質(zhì)與木聚糖酶進(jìn)行分離,從而降低這些雜質(zhì)對檢測的干擾;超濾是通過超濾膜截留生物大分子于上層,而小分子和水則會(huì)在離心力的作用下透過膜達(dá)到下層,從而對木聚糖酶和小分子雜質(zhì)進(jìn)行分離,同時(shí)兼有濃縮木聚糖酶的效果。這里選用透析袋的截留分子量為8耀14ku,超濾離心管的截留分子量為10ku,是因?yàn)槟壳鞍l(fā)現(xiàn)的木聚糖酶的分子量幾乎都在20ku以上,截留分子量10ku左右的半透膜或超濾膜即可達(dá)到理想的效果。由表1可知,透析法和超濾法的效果相差不大,超濾法要稍好一點(diǎn)。透析法是小分子經(jīng)過半透膜后在膜兩側(cè)達(dá)到平衡,根據(jù)膜兩側(cè)液體的體積比、透析時(shí)間長短等因素,小分子在膜兩側(cè)會(huì)有不同的分配比,通過延長透析時(shí)間、提高透析溫度等方法可以改善透析效果,但這些方法在這里并不是很適用,因?yàn)槟揪厶敲缸鳛樯锎呋瘎┑囊淮筇匦跃褪蔷咭鬃冃?穩(wěn)定性較差,過長的操作時(shí)間及過高的透析溫度都不利于木聚糖酶的穩(wěn)定;其次,木聚糖酶和飼料成分(包括其中的木聚糖)共處在提取液中,較長的時(shí)間、適宜的溫度等條件可能會(huì)導(dǎo)致兩者在處理過程中即發(fā)生反應(yīng),對檢測結(jié)果造成影響。因此,快捷簡便兼有濃縮作用的超濾法當(dāng)然更為適宜,而且必要時(shí)可以用冷凍離心機(jī)在低溫進(jìn)行超濾預(yù)處理,效果會(huì)更好,但超濾離心管是一次性的,且價(jià)格不菲,超濾法的成本也比透析法要高出不少。從表1中可發(fā)現(xiàn)通過透析法和超濾法處理后的樣品測得的酶活比未處理的要低一些,初步估計(jì)是未經(jīng)預(yù)處理的樣品由于受到飼料中雜質(zhì)的干擾導(dǎo)致了檢測結(jié)果偏高,但因?yàn)椴⒉恢獣愿黠暳蠘悠分械哪揪厶敲笇?shí)際添加量,所以后面的回收率試驗(yàn)也專門加入了未經(jīng)預(yù)處理直接檢測的方法的回收率考察以便于分析。2.3木聚糖酶測定結(jié)果1)準(zhǔn)確度。配制了3組不同配方的空白飼料樣品,分別添加至0.15、0.25、0.35U/g即國標(biāo)法約1.35、2.25、3.15U/g的木聚糖酶含量,分別采用透析法、超濾法和直接檢測的方法對其中的木聚糖酶活性進(jìn)行檢測,通過計(jì)算木聚糖酶的檢測結(jié)果與添加量之比得到方法的回收率。結(jié)果如表2所示。如表2所示,不采用預(yù)處理方法直接進(jìn)行檢測,測得的木聚糖酶結(jié)果會(huì)偏高;采用透析法或超濾法進(jìn)行預(yù)處理后再檢測,測得的結(jié)果較準(zhǔn)確,回收率在102%耀111%。說明飼料中的小分子雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾檢測過程,造成木聚糖酶的測定結(jié)果偏高,通過透析、超濾等合適的預(yù)處理方法去除小分子雜質(zhì)后才能獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果。此外,通過表2還可以發(fā)現(xiàn),隨著添加量的增大,測定結(jié)果的準(zhǔn)確度也在提高,特別是無預(yù)處理樣品的表現(xiàn)更是明顯。這應(yīng)該是由標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍有限導(dǎo)致的,通常普通的分光光度計(jì)在樣品吸光度值超過1.0后便會(huì)由于線性變差的原因?qū)е聹y得結(jié)果偏低,當(dāng)木聚糖酶添加量增大時(shí),樣品吸光度值也隨之升高,但由于未處理樣品的空白對照吸光度值很高,使得“空白對照+樣品”的吸光度值超過1.0,從而導(dǎo)致測得的結(jié)果偏低,而另一方面因?yàn)樾》肿与s質(zhì)干擾的緣故,未處理樣品測得的結(jié)果又是偏高的,所以,最終造成了隨著添加量的增大,測得結(jié)果的準(zhǔn)確度也在提高的現(xiàn)象。2)精密度。取不同公司的3個(gè)飼料樣品,分別對透析法和超濾法的日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行了考察。結(jié)果分別如表3、表4所示。由表3和表4可知,無論是透析法還是超濾法用于測定飼料中木聚糖酶的活性,其精密度都是符合要求的。3膜法預(yù)處理方法的選擇本文采用了透析和超濾的預(yù)處理方法對飼料提取液中的木聚糖酶和小分子雜質(zhì)進(jìn)行分離,以減少這些小分子雜質(zhì)特別是還原性物質(zhì)對MBTH法檢測木聚糖酶活性造成的干擾,通過對比分析,發(fā)現(xiàn)透析和超濾均能起到較好的分離作用,大幅降低空白對照的吸光度值,從而減少雜質(zhì)對檢測的干擾。其中,超濾法相對于透析法更快捷簡便,但成本卻要高出不少,具體選擇何種預(yù)處理方法,應(yīng)根據(jù)自身的經(jīng)濟(jì)情況及使用需要來綜合考慮。之后,通過對透析法和超濾法的一系列方法學(xué)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)無論是透析法還是超濾法,其準(zhǔn)確度和精密度都是符合要求的,說明了該方法用于測定飼料中木聚糖酶的活性是準(zhǔn)確可靠的。本