飼料中木聚糖酶的檢測方法研究

木聚糖是植物半養分的主要成分，是自然界中含量豐富的可再生資源。木聚糖是飼料中含量較高的抗營養因子,不能被動物消化道所吸收,并且阻礙其他營養成分的消化利用,因此,飼料中常添加一定量的木聚糖酶來消除木聚糖的抗營養作用,提高動物對飼料的利用率。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子中β-1,4木糖苷鍵的酶系,可將木聚糖水解為低聚木糖、木寡糖、木二糖以及少量阿拉伯糖和木糖的一種復合酶系統;不僅應用于飼料中,還廣泛應用于生物能源、食品、制藥、制漿、造紙、紡織等行業。目前檢測木聚糖酶的常用方法為二硝基水楊酸(DNS)法,此法雖然簡便快捷,但靈敏度較低,難以滿足飼料中微量木聚糖酶的檢測需求。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于檢測酚類和醛類化合物,還可與含羰基的化合物反應。因此,張永勤等已將其用于木聚糖酶的檢測,該法靈敏度高,理論上可用于飼料中微量木聚糖酶活性的測定。但實際應用時發現,由于飼料中存在多種酚類、醛類等還原性物質,均會與MBTH發生反應,其反應靈敏度又高,使得樣品空白的本底顏色過深從而影響測定,最終導致MBTH法的測定效果大打折扣,相對于DNS法并沒有明顯優勢。本文采用適當的預處理方法對飼料提取液中的木聚糖酶和小分子還原性物質進行分離,富集木聚糖酶的同時盡量減少其中還原性物質的量,避免對檢測造成干擾,再采用MBTH法測定其木聚糖酶的活性,充分發揮MBTH法高靈敏度的優勢,達到較理想的效果。1材料和方法1.1木聚糖酶及飼料木糖,木聚糖,3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH),二硫蘇糖醇(DTT),硫酸鐵銨,氨基磺酸,乙酸,乙酸鈉,氫氧化鈉等。木聚糖酶及飼料樣品均采購于市場。透析袋(截留分子量8耀14ku),超濾離心管(millipore,AmiconUltra15,截留分子量10ku),紫外-可見分光光度計(UnicoUV2800),水浴振蕩器,漩渦混合器,電子天平(萬分之一),恒溫水浴鍋,中藥粉碎機,移液器,秒表等。1.2木聚糖酶活性測定1)待測液的提取。飼料樣品按GB/T14699.1的規定進行采樣后,取適量以四分法縮分至200g左右,再粉碎并通過0.45mm標準篩,混勻后裝入密封容器內待用。取2g待測樣品于150mL錐形瓶中,加入50mmol/L的乙酸緩沖液100mL(pH值5.5),在25℃的水浴振蕩器上以150r/min提取30min,再取適量溶液以4000r/min離心10min后取上清液待測。2)透析法處理。取25mL待測液于處理好的透析袋內(截留分子量8~14ku),密封后置于250mL乙酸緩沖液(pH值5.5)中進行透析,在25℃的水浴振蕩器中透析2h后,收集透析袋內的待測液并定容至50mL,最后用MBTH法對其中的木聚糖酶活性進行分析。3)超濾法處理。取12.5mL待測液于處理好的超濾離心管中(截留分子量10ku),4000r/min離心20min后收集上層濃縮液并定容至25mL,再用MBTH法對其中的木聚糖酶活性進行分析。4)試劑的配制。MBTH顯色液:3mg/mL的MBTH溶液和1mg/mL的DTT溶液等量混合即得,現用現配,1d內有效。硫酸鐵銨試劑:準確稱量5.00g硫酸鐵銨和5.00g氨基磺酸,溶解,轉移至1000mL容量瓶中,加入36%~38%的濃鹽酸41.75mL,溶解,定容至刻度,充分混勻,轉移至棕色瓶中,于4℃冰箱貯藏待用。木糖標準溶液:精確稱取干燥至恒質量的木糖0.1001g,用緩沖液定容至100mL,得1mg/mL的木糖溶液。5)標準曲線的繪制。分別吸取木糖標準溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和2.8mL,用乙酸緩沖液定容至100mL,配制成濃度為4、8、12、16、20、24和28滋g/mL的木糖溶液。分別取上述各濃度木糖溶液500滋L(設3組平行樣),加入到500滋L0.5mol/L的NaOH溶液中,再分別加入MBTH試劑500滋L,充分混勻,80益水浴加熱15min后,迅速加入硫酸鐵銨試劑1mL,室溫冷卻后在650nm處測定吸光度值。以相應緩沖溶液代替木糖溶液制成空白樣。以木糖濃度為Y軸,吸光度值為X軸,繪制標準曲線。6)木聚糖酶活性的測定。取預處理后的待測液0.5mL,經37益預熱5min后與0.5mL木聚糖底物溶液(0.8mg/mL)于試管中混勻,于37益反應30min,加入0.5mol/L的NaOH溶液1mL,充分混合以終止反應;再分別加入MBTH試劑1mL,充分混勻,80益水浴加熱15min后,迅速加入硫酸鐵銨試劑2mL,室溫冷卻后在650nm處測定吸光度值,對照標準曲線計算木糖的生成量。而空白對照則是先在待測液中加入NaOH溶液使其中的木聚糖酶變性失活,再加入木聚糖底物溶液并進行后續的顯色反應。7)酶活計算公式。:木聚糖酶活性(U/g);E:酶反應液吸光度值;B:空白對照吸光度值;:標準曲線的斜率;:樣品的稀釋倍數;:樣品質量/g;:反應時間/min;M:木糖的摩爾質量,150.1g/mol。1.3回收率和精密度1)準確度的驗證。精確添加一定量的木聚糖酶至空白飼料樣品(未添加木聚糖酶)中,檢測其木聚糖酶的含量,通過與理論添加量的比較來考察方法的回收率。2)精密度的驗證。分別比較1d之內檢測3次和連續檢測3d結果的相對標準偏差(RSD),來考察方法的日內精密度和日間精密度。2結果與分析2.1酶活性計算MBTH法測木糖的標準曲線為,檢測樣品酶活時將各數據代入酶活的計算公式即可。2.2木聚糖酶的分離和超濾法取不同公司的飼料樣品A、B、C、D、E共5份,分別采用透析法和超濾法進行預處理,對照則不采用任何預處理方法,提取待測液后直接用MBTH法進行檢測。結果如表1所示。由表1可明顯看出,樣品經透析法或超濾法進行預處理后,空白對照吸光度值會大幅下降,如:樣品A的空白對照吸光度值為0.779,經過透析法預處理后降為0.366,經過超濾法預處理后降為0.347;樣品B的空白對照吸光度值為0.865,經過透析法預處理后降為0.406,經過超濾法預處理后降為0.392…說明透析法和超濾法都能達到對飼料樣品提取液中的木聚糖酶進行分離和富集的目的。透析是通過小分子(關鍵是會對檢測造成干擾的還原性物質)會經過半透膜擴散到緩沖液中,而生物大分子(包括木聚糖酶)則會被保留在透析袋內的原理,將小分子雜質與木聚糖酶進行分離,從而降低這些雜質對檢測的干擾;超濾是通過超濾膜截留生物大分子于上層,而小分子和水則會在離心力的作用下透過膜達到下層,從而對木聚糖酶和小分子雜質進行分離,同時兼有濃縮木聚糖酶的效果。這里選用透析袋的截留分子量為8耀14ku,超濾離心管的截留分子量為10ku,是因為目前發現的木聚糖酶的分子量幾乎都在20ku以上,截留分子量10ku左右的半透膜或超濾膜即可達到理想的效果。由表1可知,透析法和超濾法的效果相差不大,超濾法要稍好一點。透析法是小分子經過半透膜后在膜兩側達到平衡,根據膜兩側液體的體積比、透析時間長短等因素,小分子在膜兩側會有不同的分配比,通過延長透析時間、提高透析溫度等方法可以改善透析效果,但這些方法在這里并不是很適用,因為木聚糖酶作為生物催化劑的一大特性就是具易變性,穩定性較差,過長的操作時間及過高的透析溫度都不利于木聚糖酶的穩定;其次,木聚糖酶和飼料成分(包括其中的木聚糖)共處在提取液中,較長的時間、適宜的溫度等條件可能會導致兩者在處理過程中即發生反應,對檢測結果造成影響。因此,快捷簡便兼有濃縮作用的超濾法當然更為適宜,而且必要時可以用冷凍離心機在低溫進行超濾預處理,效果會更好,但超濾離心管是一次性的,且價格不菲,超濾法的成本也比透析法要高出不少。從表1中可發現通過透析法和超濾法處理后的樣品測得的酶活比未處理的要低一些,初步估計是未經預處理的樣品由于受到飼料中雜質的干擾導致了檢測結果偏高,但因為并不知曉各飼料樣品中的木聚糖酶實際添加量,所以后面的回收率試驗也專門加入了未經預處理直接檢測的方法的回收率考察以便于分析。2.3木聚糖酶測定結果1)準確度。配制了3組不同配方的空白飼料樣品,分別添加至0.15、0.25、0.35U/g即國標法約1.35、2.25、3.15U/g的木聚糖酶含量,分別采用透析法、超濾法和直接檢測的方法對其中的木聚糖酶活性進行檢測,通過計算木聚糖酶的檢測結果與添加量之比得到方法的回收率。結果如表2所示。如表2所示,不采用預處理方法直接進行檢測,測得的木聚糖酶結果會偏高;采用透析法或超濾法進行預處理后再檢測,測得的結果較準確,回收率在102%耀111%。說明飼料中的小分子雜質會嚴重干擾檢測過程,造成木聚糖酶的測定結果偏高,通過透析、超濾等合適的預處理方法去除小分子雜質后才能獲得較準確的結果。此外,通過表2還可以發現,隨著添加量的增大,測定結果的準確度也在提高,特別是無預處理樣品的表現更是明顯。這應該是由標準曲線的線性范圍有限導致的,通常普通的分光光度計在樣品吸光度值超過1.0后便會由于線性變差的原因導致測得結果偏低,當木聚糖酶添加量增大時,樣品吸光度值也隨之升高,但由于未處理樣品的空白對照吸光度值很高,使得“空白對照+樣品”的吸光度值超過1.0,從而導致測得的結果偏低,而另一方面因為小分子雜質干擾的緣故,未處理樣品測得的結果又是偏高的,所以,最終造成了隨著添加量的增大,測得結果的準確度也在提高的現象。2)精密度。取不同公司的3個飼料樣品,分別對透析法和超濾法的日內精密度和日間精密度進行了考察。結果分別如表3、表4所示。由表3和表4可知,無論是透析法還是超濾法用于測定飼料中木聚糖酶的活性,其精密度都是符合要求的。3膜法預處理方法的選擇本文采用了透析和超濾的預處理方法對飼料提取液中的木聚糖酶和小分子雜質進行分離,以減少這些小分子雜質特別是還原性物質對MBTH法檢測木聚糖酶活性造成的干擾,通過對比分析,發現透析和超濾均能起到較好的分離作用,大幅降低空白對照的吸光度值,從而減少雜質對檢測的干擾。其中,超濾法相對于透析法更快捷簡便,但成本卻要高出不少,具體選擇何種預處理方法,應根據自身的經濟情況及使用需要來綜合考慮。之后,通過對透析法和超濾法的一系列方法學驗證,發現無論是透析法還是超濾法,其準確度和精密度都是符合要求的,說明了該方法用于測定飼料中木聚糖酶的活性是準確可靠的。本