白木香內生真菌菌株boryosphaeiarhodinaa13接種后化學成分的gc-ms分析

白桂花（aquilaris）gilg，又名土香，屬于瑞香科的香蒲植物，是中國特有的熱帶和亞熱帶樹種。這是中國生產沉淀的唯一植物資源。當白木香樹干受到損傷或刺激時會分泌一種黑色樹脂,即為沉香樹脂。沉香是一種名貴中藥,其藥用始載于《名醫別錄》,列為上品。其味辛、苦,性微溫,具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效,用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥。此外,它還是一種在亞洲廣受歡迎和廣泛應用的傳統名貴天然香料。沉香的化學成分主要包括倍半萜類和2-(2-苯乙基)色酮類,按結構類型來分,倍半萜類有沉香呋喃類、杜松烷類、桉烷類、大根香葉烷類等。目前,白木香形成沉香的機理和過程并不清楚。不少研究顯示,沉香屬植物結香與真菌相關。自20世紀30年代,從沉香屬植物結香部位分離到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeriarhodina)、色二孢菌(Diplodiasp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)、毛霉(Mucorsp.)、青霉(Penicilliumsp.)、木霉(Trichodermasp.)、裂褶菌(Schizophyllumsp.)等。在本課題組的前期研究中,從白木香不同部位分離到20多株真菌。人工造香實驗發現葡萄座腔菌菌株B.rhodinaA13侵染的促香效果顯著。與空白對照相比,它能使白木香快速產生黃褐色沉香樹脂。在此基礎上,我們又對不同來源的白木香結香部位真菌類群進行研究,發現葡萄座腔菌是結香部位的優勢真菌。我們的研究結果和馮乃憲的基本一致,他從沉香木塊中分離到9株真菌,通過菌種對沉香組成成分芐基丙酮的耐受性實驗、菌種接種后人工結香木材寬度、燃燒香味比較,發現葡萄座腔菌有促進結香作用。他還對其促進結香后精油成分進行了GC-MS分析,發現含有沉香倍半萜類沉香螺旋醇以及萘酮類、酚類等沉香形成前體成分。此外,魏建和的研究結果也證實葡萄座腔菌是一種產沉香的誘導劑。為了研究真菌對白木香形成沉香的作用機理,研究人員采用了野外植株接種實驗和懸浮細胞培養方法。野外植株接種實驗能反映白木香結香的真實情況,但實驗周期長,且容易受環境中土壤、害蟲、氣候等諸多因素影響。懸浮細胞培養方法條件可控,方法簡單,但存在的主要問題是與植株實驗有差異,如研究表明在植株水平上可以在病原菌侵染部分形成局部高濃度活性氧而起一定作用,但在懸浮細胞系統中就不能形成這種局部效應。為此,本研究參照植物病理學文獻,首次建立了一種離體白木香枝條實驗模型,為研究真菌誘導白木香形成沉香的作用機理奠定基礎。1材料和機器1.1白還原樹葉片生長特性內生真菌BotryosphaeriarhodinaA13分離自白木香結香部位,保藏在廣東省微生物菌種保藏中心;新鮮白木香樹枝采自中國林業科學研究院熱帶林業研究所實驗基地;沉香醇浸膏由廣東省信宜市珍稀沉香發展有限公司提供。1.2覆壓電液RE-2000型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(II)型循環水式真空泵,鞏義市英峪予華儀器廠;DLSB-5/10低溫冷卻液循環泵,鄭州長城科工貿有限公司;FA2004電子分析天平,上海天平儀器廠;超凈工作臺,上海恒益科技有限公司;LRH-250-G光照培養箱,廣東省醫療器械廠;ThermoTraceDSQ型色譜-質譜聯用儀,美國ThermoFinnigan公司。2實驗方法2.1白象興枝移植試驗2.1.1細菌激活保藏于低溫冰箱中的菌株B.rhodinaA13挑取少量菌絲體接種到經高壓滅菌的PDA斜面上,28℃培養7d進行菌種活化。2.1.2白木耳枝條的制備將粗約0.5~1cm的新鮮白木香枝條切成約8cm左右的小段,先在0.1%升汞溶液中浸泡3~7min,取出后用無菌水漂洗3~4次,再放入75%乙醇中浸泡3~7min,無菌水漂洗3~4次,然后用滅過菌的打孔器在白木香枝條上打孔。2.1.3hodinaa13斜面菌種的制備將打孔后白木香枝條放入有濕潤無菌濾紙的培養皿上。用5mL無菌水沖洗真菌B.rhodinaA13斜面菌種,用大頭吸管吸取菌液,注入到打孔的白木香枝條上。接種后培養皿用保鮮膜封口,在黑暗、27℃環境中放置20d。同時設置未接菌的新鮮白木香枝條對照組和在PDA培養7d的菌株A13菌絲對照組,每個實驗組設置3個平行。2.2樣品前處理及gc-ms分析2.2.1微生物濾膜將各實驗組樣品放入三角瓶中,加入95%乙醇浸泡過夜,提取液旋轉蒸發儀蒸發至干,用1.5mL氯仿溶解后過0.22μm微孔濾膜,待用。設置沉香對照組,將沉香醇浸膏用氯仿溶解并過微孔濾膜后備用。2.2.2初始溫度條件氣相色譜條件:Agilent毛細管色譜柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm);色譜柱程序升溫條件:初始柱溫60℃(保持2min),以5℃/min升至150℃,再以1℃/min升至160℃(保持15min),再以8℃/min升至250℃(保持20min);傳輸線溫度250℃,載氣為高純氦氣,流速1.0mL/min;進樣量1μL,程序升溫汽化不分流進樣,初始溫度60℃,14.5℃/min升溫至250℃。質譜條件:電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度230℃;掃描質量范圍(m/z)40~500。各實驗組組分采用NIST2002質譜數據庫檢索進行定性,采用色譜峰面積歸一法進行相對定量。3結果3.1白色抗菌、組織在接種后2~4d,離體白木香樹枝打孔處長出白色菌絲體。隨著培養時間的延長,在9~12天,菌絲布滿整條樹枝以及平皿上的濾紙,顏色由白色變成黑色(圖1)。3.2化學成分分析(菌株A13+樹枝)實驗組的提取物采用GC-MS鑒定出11個化合物,其化學成分主要是吡喃酮、脂肪酸、烷醇和萜類,其中萜類化合物包括2,6-二甲基,1,7-辛二烯-3-醇、異葉綠醇、葉綠醇、3,7,11-三甲基,1-月桂醇和5,9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環癸醇。沉香對照組提取物中鑒定出24個化合物,其化學成分主要是萜類、脂肪酸和烷醇類,其中萜類化合物包括反-松香芹醇、雙環大根香葉烯、香橙烯、綠花白千層醇、5,9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環癸醇。樹枝對照組提取物中鑒定出8個化合物,主要是脂肪酸和烷醇類。菌株A13對照組提取物鑒定出9個化合物,主要是炔類、脂肪酸和烷醇類(表1,圖2)4分離的菌株a3研究結果顯示,未接菌的離體白木香樹枝對照組和PDA培養7d的菌株B.rhodinaA13對照組提取物中未檢出萜類化合物,而接種A13菌株的離體白木香樹枝實驗組和沉香對照組中都有萜類化合物,包括大根香葉烷類倍半萜5,9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環癸醇。這說明菌株A13能誘導離體白木香枝條形成沉香倍半萜類化