臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識近年二代基因測（next—generationsequencinNGS)技術快速發展,其應用已進展至臨床檢測如遺傳疾病實體進行了充分討論擬在NGS的操作流程數據處理結果解讀等方面作規范和建議，以規范NGS在分子病理領域的應用。臨床分子病理實驗室NGS樣本可采用甲醛固定石蠟包埋組織(formalin-fixedparaffin—embedded，FFPE、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊、石蠟包埋標本和血漿/血液標本等本共識特色是基于病理評估的組織樣（FE、重在于目標區域測l實踐術的更新和應用的成熟，本共識將持續更新以滿足臨床需求。一、實驗室總體要求NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參《分子病理診斷實驗室建設指南(試行《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則《個體化醫學檢測質量保證指南《腫瘤個體化治療檢測技術指南《個體化醫學檢測實驗室管理辦法《測序技術的個體化醫學檢測應用技術指南（試行)》進行。1NGS檢測人員的資質要求:NGS檢測技術人員應具備臨床單位執業醫師或者授權簽字人(醫學博士學位或高級職稱核2.NGS檢測實驗室的區域設置要求原則上NGS實驗室應當有以下分區：樣本前處理區、試劑儲存和準備區、樣本制備區文庫制備區區多重（第一擴增區文庫擴增區（第二擴增區、文庫檢測與質控區、測序區、數據存貯區各工作區空氣及人員流向需要嚴格按《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則.分區可根據實際情況合并理和建庫時血液樣本應與組織樣本分開.3。NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監督管理總局（CFDA)認可產品。涉及到實驗室（P經過臨床實驗室自建項目(LDT)驗證合格才可使用每個NGS以及不同的突變類型包括，單堿基突變singlenucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels、基因拷貝數變異Copynumbervariations，structuralvariation(SVs）以及不同的樣本類型（如FPE組織新鮮組織全血胸水等)對特定panel的準確性、LDT有經過標準品測試的在不同的muttalllerqueisMAF）下,不同測序深度的靈敏度及特異性數據確定不同樣本的可信的測序深度經驗證后SOP發生的任何改動儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結果簽名留底備案。4。NGS檢測實驗室的質量管理要求：NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息學分析兩部分.實驗操作部分包括樣本準（bang；生物信息學分析部分包括定pping比對變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SO具有嚴格和改進計劃。二NGS分析樣本、基因panel和轉運要求NGS分析樣本類型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿/血液標本等.對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應首選經病理評估的組NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質及含量根據不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序.不同疾病的基因pal列表,必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。未經病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。估的樣本進一步明確病理診斷,并評價標本有無出血壞死和不利于核酸檢測的前處（例如含HCl脫鈣液處理變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20％以上，低于此標準可富集后檢測NGS檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理SOP導。對于不同的樣本FE、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送SOP物流環節(含冷鏈運輸相關運送記錄,確保樣本運送安全、無污染、無降解。三、NGS檢測流程中的質量標準1核酸提取及其質量分析提取的核酸質量是NGS檢測成功的關鍵因素在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估，包括純度濃度和完整性分析.需要根據不同的樣本類型制定SOP用以鑒定核酸的純度濃度完整性或降解程度等.并對應明確接受和拒絕的標準。2文庫制備及其質量分析:文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測S析.每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。3。NGS測序儀上機分析及其質量分析：NGS建庫主要有擴確定適當的芯片以保證測序質量和靶區覆蓋深度.錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進行測序。產生的測序數據質量參數要求詳見后文。4。NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：(1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染可選用多個SNV或其他標簽作為樣本身份標識（sampleID，在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染（型質控材料可采用已知突變信息的混合樣本,以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。(3）陰性對照:用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測以確保檢測過程中沒有污染或非特異性.（4）應對方案和替代方法各個質量控制步驟中如出現異常或失敗,實驗室應有應建立替代方法（如Sanger測序）.四、生物信息分析NGS數據的生物信息分析可分為兩個主要步驟位點鑒定分析并注釋.用各種生物信息分析軟件都要通過臨床報告的要求.1.NGS生物信息分析流程標準（1析:果的可靠性，需要對原始的測序數據進行質量控制與過濾。測序數據的質量控制主要包含4去低質量序列去重復序列（序列比apping：將通過質控后每一條read與參考基因組進行比對因組上最佳位置。(3)變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤panel測序中SNVIndel兩種突變類型，參數調整后可分析CNV部分panel的設計還可以鑒定染色體易.對于腫瘤nel基因測序數據的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認，如TheIntegrativeGenomicsViewer（IGV）.（4）變異注釋：基于通用數據庫對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。2.NGS生物信息分析流程質量管理：實驗室應建立生物信息學程序/Pipeline)準品進行驗證,驗證其特異性和靈敏度是否達到實驗室要求。驗證結果簽名留底備案1NGS數據存儲：實驗室需要在生物信息分析過程中對原始數據及最后的結果數據進行標準化存儲，并要保存相應的年限以備查。(2)版本可追溯性：實驗室需要建立一個異常記錄文檔用來記錄偏離NGS生物信息分析標準分析流程的檢測。3.NGS生物信息分析質量指標：原始文件及比對結果文件的質量指標見表1。表14.NGS數據存儲格式標準:為了規范和管理各類數據,各個5。NGS數據存儲傳輸及共享安全標準：實驗室需要制定規章制度以確認測序數據在內部及外部存儲及傳輸過程中的安全性和機密性。正常人群的變異數據應該共享。五、NGS結果解釋及報告1.NGS臨床報告包含內容基于高通量測序技術,臨床實驗室定性。但NGS的檢測報告建議體現以下內容：（1）檢測名稱，如XXX基因變異檢測報告。名,室及醫師等。（3（FFPE血液等、送檢日期、報告日期等.（4）病理信息，腫瘤組織類型、位置、TNM分期、細胞含量腫瘤細胞比例說（出血壞死酸脫鈣處理等panel軟件版本號等。（6）結果列表應包含基因名稱、變異在染色體位置、變異頻率DNAGenbank號（NM開頭）及符合人類基因組變異協HneraoneyHGVS書寫規范的突變類型、編碼蛋白Genbank號NP開頭）及突變類型、雜合純合狀態等。（7）臨床意義解讀和批注:體細胞突變，報告各個腫瘤檢測到的變異位點及臨床意義.胚系突變對于檢測到的變異位點描述在疾病相關性只描述既往研究中的療效或預測不能出現使用何種治療手段或策略的語言.（8）若檢測失敗，應闡述失敗原因.（9）最終報告應由檢測者、報告醫師或指定審核人聯合簽發2。基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時要遵循(wwhgvsorg)名,推薦美國醫學遺傳學學院（AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomihtps/wwacmgn類指導的命名、遺傳背景說明以及權威文獻說明。3變,根據突變的類型和已有的報道及指南,A級品管理局（FA）或中國食品藥品管理局（CA）批準的用藥治療靶點;寫入中外診療指南有明確診斷治療/預后意義的變異。在報告注釋該變異位點的臨床診斷治療預后意義的權威指南來源.B級：尚未進入診療指南，但已經寫入該領域的專家共識的變異位點.注釋時要批注研究報道及專家共識的來源,明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態等信息。C級：FDACFDA批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異，或者正在進行中的臨床試驗變異位點。注釋時要批注用態等信息.D級：處于學術爭議或臨床意義不明確的基因變異。同一實驗室應該有統一的政策用來應對檢測過程中出現的臨床意義不明變異情況。對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測略的語言.對于遺傳疾病（germlinemutation）檢測，除了中外診療指南及重要參考文獻以外,推薦兩個數據庫:OnlineMendelianInenn（hp//ommog/傳