產紅霉素C的糖多孢紅霉菌A226G【摘要】糖多孢紅霉菌eryG基因編碼產物為紅霉素3"O甲基轉移酶(EryG)，失活eryG基因能阻斷紅霉素A的生物合成，積累其中間產物紅霉素C。以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模版，用重疊PCR方法擴增出eryG基因兩側約1600bpDNA片段(ΔG)，其中去除了EryG上S腺苷甲硫氨酸結合區域對應的290bpDNA片段。將該片段克隆于質粒pWHM3，構建了同源重組質粒pWHMΔG。PEG介導原生質體轉化法將pWHMΔG轉入糖多孢紅霉菌A226中，通過染色體同源重組突變染色體上eryG基因。利用薄層層析、PCR和質譜方法篩選出一株eryG基因突變的糖多孢紅霉菌A226G-突變體，此突變體主要積累中間產物紅霉素C而不再合成紅霉素A。通過eryG基因的功能補償，糖多孢紅霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢復紅霉素A的合成能力。

【關鍵詞】糖多孢紅霉菌；紅霉素；3"O甲基轉移酶；同源重組；功能補償

ABSTRACTSaccharopolysporaerythraeaerythromycin3"Omethyltransferase(EryG),encodedbytheeryGgene,couldplayanimportantroleinerythromycinbiosynthesis,andtheinactivationoferyGgenewouldleadtoerythromycinCaccumulationintheeryGmutantfermentationculture.TakingSac.erythraeagenomicDNAasatemplate,about1,600bpDNAfragmentwithdeletionofa290bpfragmentwhichcontainedSadenosylmethioninebindingdomainineryGgenewasamplifiedbyoverlapPCRandclonedintothevectorpWHM3toconstructhomologousrecombinationplasmidpWHMΔG.ItwasthenintroducedintoSac.erythraeabyPEGmediation,andtwointegrants(IandII)wereselected.AfterintegrantIhadgrownforthreegenerationsonR3Mmediawithoutthiostrepton(Thio),theywereprotoplastedandplatedonR3MmediawithoutThio.Onemutant,A226G-,wasscreenedandidentifiedbyTLC,PCRandMSanalyzes.TheA226G-mutantaccumulatederythromycinCinsteadoferythromycinAintheculture.ByintroducingeryGgeneexpressionvectorintoA226G-mutant,erythromycinAproductionwasrestored,buttheyieldwassomewhatlowerthanthatofitsparentstrainA226.

KEYWORDSSaccharopolysporaerythraea;Erythromycin;3"Omethyltransferase;Homologousrecombination;Functioncompensation

紅霉素(erythromycin，Er)是由革蘭陽性細菌糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的次生代謝產物，為一類大環內酯類抗生素，包括紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素C(ErC)和紅霉素D(ErD)等。這四種紅霉素均有抑菌活性，但在臨床上抑菌活性最高，用途最廣泛的是ErA［1，2］。

紅霉素的生物合成分為兩大部分：紅霉素母核6脫氧紅霉內酯B(6dEB)的合成和6dEB的后修飾。前者由1分子丙酰輔酶A和6分子甲基丙二酸單酰輔酶A在聚酮合成酶復合體(PKS)的催化作用下完成，其過程類似于飽和脂肪酸的合成反應；隨后6dEB在紅霉素C6位羥基化酶及在C3位和C5位羥基糖基化酶作用下形成了第一個有活性的中間產物ErD；ErD可以先在C12位羥基化酶EryK作用下形成ErC，再在3"O甲基轉移酶EryG作用下形成ErA，還可以通過另一條次要途徑，即ErD先在EryG作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA［1，2］。

紅霉素生物合成的基因以單一拷貝、成簇形式存在于糖多孢紅霉菌的環形染色體上，質粒不參與紅霉素的生物合成［1，3］。

糖多孢紅霉菌紅霉素EryG是一種S腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基化酶，在ErA生物合成過程中對中間產物ErC和ErD進行甲基化修飾，在降低紅霉素的毒性和提高紅霉素的活性方面起著重要的作用［1～4］。利用基因敲除技術阻斷EryG編碼基因(eryG)功能可以積累ErA生物合成的中間產物ErC。本研究構建了紅霉素eryG基因失活的糖多孢紅霉菌突變體A226G-，為進一步研究EryG與其底物(SAM、ErC和ErD)的定量關系以及EryG的其它相關酶學性質奠定了基礎。

1材料與方法

材料

(1)菌種和質粒糖多孢紅霉菌A226、大腸埃希菌ET12567［5］和同源重組質粒pWHM3［6］由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所王以光教授惠贈；糖多孢紅霉菌染色體整合型表達載體pZMW［7］、大腸埃希菌DH5α［8］和克隆質粒pUC18為本室保存；質粒pUCΔG、pWHMΔG、糖多孢紅霉菌突變體A226G-、質粒pZMWG和糖多孢紅霉菌基因工程菌A226G-G+為本研究構建。

(2)培養基、緩沖液和試劑LB培養基按Sambrook等［8］方法，TSB培養基按Hopwood等［9］方法，R3M培養基按Summers等［10］方法，PEG3350T緩沖液和改進P緩沖液按Yamamoto等［11］方法配制。

硫鏈絲菌肽(thiostrepton，Thio)、安普霉素(apramycin，Am)和PEG3350為Sigma公司產品，溶菌酶為Fluka公司產品，蛋白酶K為Amresco公司產品，TSB為Difco公司產品，限制性內切酶、T4DNA連接酶和DNAMarker(DL2000和DL15000)為大連寶生物公司產品，RNaseA、dNTP、pfu和TaqDNA聚合酶為上海生工公司產品，質粒提取試劑盒和PCR產物回收試劑盒為道普生物科技(北京)有限公司產品，其它試劑為分析純。

方法

(1)大腸埃希菌的培養、感受態細胞的制備、質粒酶切、連接、轉化等按Sambrook等［8］方法或產品說明書進行；質粒提取、PCR產物純化按道普生物科技(北京)有限公司產品說明書進行。

(2)糖多孢紅霉菌A226的培養和基因組DNA的提取按Hopwood等［9］方法進行。

(3)ΔGDNA片段重疊PCR引物的設計

為刪除糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3"O甲基轉移酶編碼基因eryG中間部分290bpDNA序列(對應于GenBank登記號AM420293序列中的823972～824261nt)，在刪除位點兩側各擴增一段同源片段。為了兩同源片段間進行重疊PCR擴增，上游片段Fra1的反向引物和下游片段Fra2的正向引物完全互補，這樣經重疊PCR擴增的DNA片段是不含有EryGSAM結合位點DNA的約1600bpΔGDNA片段［16］。

上游片段Fra1引物

P11：5′accGAATTCtgtacaacctggcggtccggcacg(大寫字母表示EcoRI識別位點)；

P12：5′ctccaccgggatgccgccggacagcggtcaggtcgacgccgacgatcctggcc。

下游片段Fra2引物

P21：5′ggccaggatcgtcggcgtcgacctgaccgctgtccggcggcatcccggtggag；

P22：5′gaAAGCTTgggcaccgccggcgagatcg(大寫字母表示HindIII識別位點)。

(4)eryG基因PCR引物的設計是根據GenBank公布的糖多孢紅霉菌紅霉素eryG基因序列(GenBank登記號AM420293)，設計并合成了1對引物

上游引物P1：5′cggCATATGagcgtgaagcagaagtcagc(大寫字母表示NdeI識別位點)；

下游引物P2：5′gtgAAGCTTGATATCtacgcgccgggcttg(大寫字母表示HindIII和EcoRV識別位點)。

(5)ΔGDNA片段和eryG基因片段的PCR擴增按文獻［12］操作。

(6)糖多孢紅霉菌A226原生質體的制備和轉化按文獻［13］操作。

(7)糖多孢紅霉菌A226::pWHMΔG整合體I和II及糖多孢紅霉菌A226G-突變體的篩選按文獻［14］操作。

(8)糖多孢紅霉菌A226::pWHMΔG整合體I和II及A226G-突變體發酵液中紅霉素成分的薄層層析(TLC)分析按文獻［4］操作。

(9)糖多孢紅霉菌A226::pWHMΔG整合體I和II的PCR鑒定按文獻［14］操作。

(10)糖多孢紅霉菌A226G-突變體PCR鑒定的引物序列設計按(4)節中設計的引物序列。

(11)糖多孢紅霉菌A226G-突變體發酵液中紅霉素成分的質譜(MS)分析按文獻［14］操作。

2結果與分析

同源重組質粒pWHMΔG的構建

以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模板，PCR先擴增出上游片段Fra1和下游片段Fra2，再以Fra1和Fra2為模版、P11和P22為引物，用重疊PCR擴增出全長約1600bp的DNA片段ΔG，克隆到pUC18載體上構建質粒pUCΔG。序列分析表明，所克隆的ΔGDNA片段序列與GenBank公布的序列完全一致(290bpDNA片段已被刪除，測序圖略)。

pWHM3質粒［6］為穿梭型質粒，在糖多孢紅霉菌中不能穩定存在，故可作為糖多孢紅霉菌的同源重組質粒。pUCΔG質粒中外源DNA用EcoRI和HindIII酶切后連于pWHM3質粒相應酶切位點上，轉化大腸埃希菌DH5α獲得了pWHMΔG質粒()。

為避免糖多孢紅霉菌對外源基因的限制性作用(甲基DNA限制)［15］，將pWHMΔG質粒轉化大腸埃希菌ET12567，得到了無甲基化修飾的pWHMΔG質IdentificationofpWHMΔGcutbyEcoRI/HindIII粒。

糖多孢紅霉菌A226::pWHMΔG整合體I和II的篩選

將糖多孢紅霉菌A226制成原生質體，用pWHMΔG質粒轉化，在含30μg/mlThio的R3M固體培養基上進行篩選。因pWHMΔG質粒在糖多孢紅霉菌中不能復制，只有整合到染色體上才能賦予菌體穩定的Thio抗性。從轉化平皿中挑取110個單菌落涂含30μg/mlThio的R3M斜面，有2個菌落可正常生長，分別命名為A226::pWHMΔG整合體I和II。提取整合體I和II基因組DNA做模板，分別以質粒pWHMΔG和出發菌株A226基因組作為陽性和陰性對照，PCR擴增pWHMΔG質粒上Thio抗性基因tsr進行鑒定。%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，整合體I和II的PCR產物與陽性對照一樣，大小位于768bp附近，與預期相符，而陰性對照并無此條帶()，表明pWHMΔG質粒已整合到A226的染色體上。

糖多孢紅霉菌紅霉素生物合成基因在染色體上以單一拷貝、成簇形式存在，其中eryAI、eryAII、eryAIII、eryCII、eryCIII、eryBII和eryG為一條多順反子，共同受到eryAI啟動子的控制［1］。若pWHMΔG質粒與A226染色體在同源片段Fra1內發生同源重組，那么eryG基因的表達將會受到抑制，整合體發酵液就會積累ErA生物合成的中間產物ErC；若在同源片段Fra2內發生同源重組，那么eryG基因的表達將不會受到影響，整合體仍然可以合成ErA。

為了確定pWHMΔG質粒的整合位置，提取整合體I和II發酵液中的紅霉素進行薄層層析(TLC)，TLC結果顯示整合體I是在同源片段Fra1內發生同源重組的，而整合體II是在同源片段Fra2內發生同源重組的()。

糖多孢紅霉菌A226G-突變體的篩選

同源重組質粒pWHMΔG在染色體上不穩定，在無抗生素選擇壓力時會自發發生染色體內二次重組而脫落。若第二次重組與第一次重組發生在同一同源片段內，質粒脫落后染色體會回復到質粒整合前狀態，菌株恢復ErA合成能力；若第二次重組與第一次重組發生在不同的同源片段內，質粒脫落后eryG基因DNA序列會發生刪除突變，突變株將失去ErA合成能力，發酵液中會有ErC的積累。

糖多孢紅霉菌A226::pWHMΔG整合體I在無Thio的R3M斜面上連續生長三代后，將制得的原生質體不同濃度稀釋液涂無Thio的R3M平皿。從平皿中挑取約1000個單菌落，各連續涂含30μg/mlThio的R3M斜面和無Thio的R3M斜面，其中有5個菌落僅可以在無Thio的R3M斜面上生長，表明這5個克隆中同源重組質粒pWHMΔG已從A226染色體上脫落下來。提取這5個克隆的紅霉素做TLC，結果顯示只有4號克隆僅可以積累ErC，此克隆被命名為A226G-()。其余4個克隆都為回復突變，即恢復了ErA的合成能力。

將A226G-突變體進行液體培養，提取基因組DNA，以eryG基因上游引物P1和下游引物P2進行PCR擴增，A226G-突變體PCR產物的條帶明顯地比A226的要小()。對A226G-突變體的PCR產物直接進行序列分析也表明此突變株eryG基因中間部分預期的290bpDNA片段已被刪除(測序圖略)。

糖多孢紅霉菌A226G-突變體發酵產物的質譜(MS)鑒定經乙酸乙酯萃取和水浴濃縮后用質譜(MS)方法檢測發酵產物中紅霉素成分。MS僅檢測到了ErC的質譜峰()：/z為［ErC］H+，/z為［ErCH2O］H+。在發酵液中也沒有檢測到上一步中間產物ErD，說明糖多孢紅霉菌紅霉素C12位羥基化酶EryK可以完全地把ErD轉化成產物ErC。

A226G-突變體中eryG基因的功能補償

(1)糖多孢紅霉菌表達質粒pZMWG的構建以糖多孢紅霉菌A226總DNA為模板，以P1和P2為引物PCR擴增出eryG基因，克隆到pUC18載體上構建了質粒pUCG。序列分析表明，所克隆的eryG片段序列與GenBank公布的序列完全一致(測序圖略)。

將pUCG中的eryGDNA片段亞克隆至糖多孢紅霉菌表達載體pZMW中，構建了質粒pZMWG。NdeI和EcoRV酶切pZMWG質粒后獲得預期大小的兩個片段()。

(2)互補試驗將糖多孢紅霉菌突變體A226G-制成原生質體，用pZMWG質粒轉化，在含125μg/mlAm的R3M固體培養基上進行篩選。從轉化平皿中挑取6個單菌落涂含125μg/mlAm的R3M斜面，這6個克隆均可正常生長，命名為A226G-G+I、II、III、IV、V和VI。接種A226G-G+I和A226于100mlTSB培養基/500ml三角燒瓶中，30℃振蕩培養120h，提取發酵產物紅霉素，TLC結果顯示A226G-G+I恢復了ErA的生產能力()。

3討論

基因敲除技術是20世紀80年代末發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術，因此基因敲除技術在特定基因功能的研究中顯示出越來越重要的地位。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，達到基因敲除、失活的目的。

1991年Haydock等［16］對糖多孢紅霉菌紅霉素3"O甲基轉移酶編碼基因eryG進行了測序，并通過比對EryG和其它幾種甲基轉移酶的氨基酸序列發現，eryG開放閱讀框(ORF)由921對核苷酸組成，編碼產物EryG有306個氨基酸；大多數甲基轉移酶的氨基末端都有一個富含甘氨酸(Gly)的SAM結合位點基序，保守區序列為VLE/DXGXGXG［16］。本研究發現，在A226G-發酵液中未檢測到任何ErA的特征性質譜峰，說明A226G-突變體中的eryG基因已徹底失活，其編碼產物EryG不再具有甲基轉移酶活性。

Reeves等［17］通過S1核酸酶保護實驗預測紅霉素eryG基因可能有單獨的啟動子，但迄今為止并沒有有力的文獻證實。在本研究中，整合體I紅霉素發酵液乙酸乙酯提取物經TLC分析仍可見到少量的ErA斑點()，MS分析也表明發酵液中既有ErC又有ErA(圖譜略)，說明即使是在同源片段Fra1內發生同源重組也沒有完全阻斷eryG基因的表達。糖多孢紅霉菌A226G-突變體發酵液中只有ErC的積累，所以綜合這兩點可以說明eryG基因確實有單獨的啟動子。

糖多孢紅霉菌表達質粒pZMWG能夠恢復A226G-突變體ErA的合成能力，但通過TLC和紅霉素敏感菌枯草芽孢桿菌PUB110(BacillussubtilisPUB110)抑菌試驗進一步分析發現，基因工程菌A226G-G+中ErA的產量比野生菌A226的產量低，原因推測有如下三條：①質粒pZMWG整合到染色體上某一位置可能會影響紅霉素基因簇的轉錄。有文獻報道［18］糖多孢紅霉菌染色體上至少有7個ΦC31attB類似位點(attBlikelocations)可與pZMWG質粒中的ΦC31attB位點發生位點特異性重組，但是這些attB類似位點無一含有較好的一致序列。所以pZMWG質粒經位點特異性重組整合到染色體上某一ΦC31attB類似位點或者經同源重組整合到eryG位點上可能會影響紅霉素基因簇的整體轉錄水平；②質粒pZMWG中eryG基因所用的啟動子與紅霉素基因簇中基因的啟動子爭奪RNA聚合酶全酶(即其中的sigmafactor)和/或調控蛋白因子。本實驗室構建的表達載體pZMW［7］中表達外源基因的啟動子，為紅霉素抗性基因ermE啟動子的一部分片段，此片段恰巧含有ermEP1、P2和eryCIP1、P2，所以這些調控序列可能會與紅霉素基因簇中的啟動子等調控序列爭奪共用的調節因子；③micRNA(mRNAinterferingcomplementaryRNA)，紅霉素基因簇中ORF5推測為硫酯酶基因，ORF5插入失活導致紅霉素產量嚴重降低［17］，由于ORF5與紅霉素eryG基因3′端有24nt重疊，所以基因工程菌體內過多的eryGmRNA3′端降解片段可能會干擾ORF5的表達。

巨大霉素［19，20］和紅霉素A的生物合成有著共同的中間產物紅霉素C，所以本研究構建的eryG基因失活的糖多孢紅霉菌A226G-突變體，不但為進一步深入研究EryG相關的酶學性質奠定了基礎，而且也為研究巨大霉素生物合成中紅霉素C相關的修飾酶提供了一個研究系統。

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