胚胎體外培養和胚胎評估的培訓胚胎體外培養胚胎評估空氣、振動、光照…培養箱外環境人員/操作培養流程℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培養箱內環境氣體、

濕度、培養皿、油…培養液胚胎體外培養體系培養箱外環境空氣及污染物振動、噪音光照室內濕度揮發性有機化合物VOC總揮發性有機化合物（TVOC）：熔點低于室溫沸點50～260℃揮發性有機化合物的總稱世界衛生組織(WHO,1989)

VOC分類苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二異氰酸酯（TDI）二異氰甲苯酯有機氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂類石油烴類有機酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等測定VOC先俘獲、后測定各種VOC的俘獲方法不同測定總VOC？目前測定的“TVOC”：6~13個碳原子的苯系有機物其他VOC有各自的俘獲測定方法未知VOC很難測定塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子十萬級：3500000/m3萬級：350000/m3千級：35000/m3光照來源：室內照明燈、顯微鏡光源危害：損害線粒體培養液成分分解紫外線產生活性氧，對所有細胞有害光照豚鼠卵，超過一小時，影響后續受精和有絲分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的結論——兔卵進行光照20～30分鐘后，隨后的受精率和著床率并未受到明顯影響相對濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣RH=絕對濕度/飽和濕度30℃30g水蒸氣RH=43.5%RH=33.3%理想的室內相對濕度？設備抑制霉菌人員減少液體蒸發010030~60%培養箱內環境氣體溫度培養皿液滴培養方式油氣體二氧化碳培養箱CO2℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三氣培養箱桌面式培養箱N2氣體純度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2高濃度氧，胚胎基因表達異常？低氧培養改善體外胚胎發育低氧培養，人囊胚細胞數增加低氧培養低氧培養部分文獻——不必要低氧?培養液內，添加了抗氧化物質（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影響37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIOASRM，2013年支持低氧環境利于囊胚形成！低氧同樣利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2薈萃分析，隨機對照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活產率從32%提高到43%溫度鼠胚室溫5分鐘——降低卵裂率15分鐘——囊胚形成率減半人卵母細胞——低溫損害紡錘體溫度——紡錘體解聚與恢復33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消失37℃后,10分鐘內恢復28℃，解聚加快，恢復時間長，20分鐘不能完全恢復液滴/培養方式單獨培養集合培養胚胎自分泌、旁分泌作用減小體積適當增加胚胎數目液滴自分泌旁分泌集合培養——依據鼠、羊、牛胚胎培養證據具體旁分泌因子未確定集合培養——方法20～50ul2～5個胚胎/液滴蓋油（石蠟油、礦物油）液滴礦物油液滴液滴集合培養缺點：不利于單個胚胎的連續觀察解決1：按Day3形態學評分分組培養8細胞碎片0～10％8細胞碎片20～40％6細胞碎片20～50％解決2：特殊培養皿液滴培養液培養液種類水、離子碳水化合物氨基酸pH值及緩沖物質維生素，抗生素螯合劑抗氧化物質蛋白質，大分子激素，生長因子培養液種類序貫培養液單一培養液序貫培養mmol/LGardner,1998序貫培養葡萄糖不利于分裂期胚胎發育囊胚主要能量來源EDTA利于分裂期胚胎發育抑制囊胚內細胞團發育氨基酸序貫培養系統Day1~Day3:卵裂期培養液Day3~Day6：囊胚培養液單一培養液？單一培養：簡化流程，形成率類似Day3換液Day3不換液！pH值與緩沖物質pH：代表氫離子濃度pH與細胞各種生理功能關系極密切pH指示劑：酚紅緩沖物質：維持pH穩定，成對或一種：碳酸鹽緩沖對、MOPS、HEPES1pH值147pH值與CO2濃度最重要的緩沖對碳酸鹽緩沖對：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕培養系統的pH值7.2-7.4碳酸鹽體系不穩定！暴露空氣會使PH迅速升高蓋油減少培養基氣體交換CO2濃度影響因素設定值：5%？6%傳感器類型培養箱開門方式溫度、濕度無機離子參與滲透壓形成高濃度氯化鈉不利于鼠囊胚形成胞外鎂和鈣的水平與早期胚胎細胞對細胞內穩態調節能力有關磷在含有葡萄糖的簡單培養基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的發育無機離子銨氨基酸代謝及自然分解產生的氨會導致胚胎毒性物質-銨離子的積累銨離子可以改變胚胎分化、代謝及基因表達會嚴重降低移植后種植率及胎兒發育率抗生素培養基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素主要作用時防止培養基的細菌污染蛋白質/大分子物質白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效應如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血漿蛋白粉、5%血漿蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）阻止培養液的蒸發及培養基pH的變化種類：礦物油石蠟油油培養液儲運冷鏈運輸，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器導致培養液堿化，鎂離子沉淀減少細菌污染風險分裝目的：減少開瓶次數分裝量：根據使用情況，一次一支分裝容器，與量匹配標記分裝日期胚胎移植－移植時期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植在體內此時的胚胎是在輸卵管內，而不是在子宮內卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植囊胚培養進一步篩選胚胎靈活的移植時間便于PGD/PGS減少異位妊娠囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta2012年齡人員及操作人員數量適當每項關鍵技術均至少2人能熟練實施確保足夠人力實現雙人復核衛生部（衛科教[2003]176號文件）規定，實驗室專業技術人員不得少于3人。年周期超過1000個周期的中心需要適當增加技術人員每名全職胚胎學家完成250~400周期/年人員及操作操作時間對卵、胚胎的應激核對胚胎體外培養胚胎評估卵巢刺激后獲得的胚胎發育潛能不一致減少移植胚胎數，挑選正確的胚胎！胚胎評估、胚胎選擇是IVF實驗室技術中的核心常規胚胎形態學評估始于第一例IVF-ET1981年Edwards闡述了形態學評估的方法胚胎形態學評估多種評分體系可進行胚胎形態學評估缺點依賴操作者主觀能力優勢快速而有效Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由資深胚胎學家組成的國際組織Alpha共識embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistIstanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010胚胎的形態學指標透明帶極體卵周隙胚胎形狀裂球數量裂球形狀裂球排列原核碎片多核顆粒空泡致密化囊胚腔大小ICM形狀TE細胞數早卵裂Righttime，rightembryo！評估時間觀察內容受精后時間Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst原核期評分1998年前后提出原核核仁的數量，排列原核大小及排列胞漿狀態2001年,原核期評分能夠預測囊胚形成，與妊娠率相關近10余年一直存在爭議，研究多為回顧性2011年time-lapse：對評分方法提出質疑原核期評分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB早卵裂24～27小時的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是發育能力的重要標志后多人研究證實分裂對稱性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評分Day3細胞數Edwards提出人早期胚胎有相對固定的發育速度超出或低于此速度，均影響后續發育大量文獻：細胞數——種植率、囊胚形成率！[i]

AlikaniM.HumReprod2000碎片碎片：無細胞核，細胞膜包裹的細胞外胞漿結構（Alikani，1999）細胞代謝或分裂過程異常造成的凋亡過程染色體異常造成碎片？僅僅是目前我們對碎片的認識“細胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um碎片對胚胎發育的后續影響——局部融合Day4可能發生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外局部融合——囊胚質量下降卵裂球對稱性文獻非常少卵裂球嚴重不均勻的胚胎種植率下降Hardarson，2001多核現象可能與染色體異常有關囊胚形成率下降種植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007Day3胚胎形態學評價細胞數與碎片含量，哪個指標更重要？在所有形態學指標中，細胞數是最重要的獨立的預測胚胎活性的指標！RonitMachtinger，2013細胞數與囊胚形成率北京協和醫院婦產科PUMCH－OBGYN碎片、細胞數與day6囊胚形成北京協和醫院婦產科PUMCH－OBGYN卵裂期胚胎評估細胞數少于8個＝種植能力下降多于8個＝種植率可能下降碎片:定義:d2<45μm;d3<40μm分級：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要記錄碎片位置多核現象:一個卵裂球內超過一個細胞核;d2評估細胞大小:2-,4-,和8-cell階段應均勻卵裂期胚胎分級GradeRatingDescription1Good<10%fragmentationstage-specificcellsizenomultinucleation2Fairupto25%fragmentationstage-specificcellsizeformajorityofcellsnoevidenceofmultinucleation3Poorseverefragmentation(>25%)cellsizenotstage-specificevidenceofmultinucleationday4胚胎形態（桑葚胚）相關文獻很少GradeA~F(2011)致密化與滋養層的形成有重要關系致密化非常重要Day4胚胎分級GradeRatingDescription1GoodEnteredintoa4throundofcleavageEvidenceofcompactionthatinvolvesvirtuallyalltheembryovolume2FairEnteredintoa4throundofcleavageCompactioninvolvesthemajorityofthevolumeoftheembryo3PoorDisproportionatecompactionof<?embryo,withsomecellsremainingasdiscreteblastomeres囊胚質量評價Gardner評分方法1～6期6期5期4期3期2期ABCABC囊胚形態學評估滋養細胞層重要？內細胞團重要？第5天新鮮SET的回顧性研究形態學指標（擴張程度、ICM和TE