免疫組化染色質量控制在鼻咽組織切片中的應用

鼻咽組織;免疫組織化學;標準化;質量控制

QualityControlofImmunohistochemicalStainiginSliceofNasopharynxTissues

Abstract：ObjectiveToestablishastandardempiricalprocessofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuescateringtotherequirementforpathologicaldiagnosisandresearchintheIntroducingthemethodsofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuesaswellasthelinkofqualitycontrolindetail.ResultsTheresultsshownthatmethodhasthreefeatures:stableandreliable,strongspecificity，andhighsensitivity.ConclusionThismethodcanimprovethequalityofimmunohistochemicalstainingofnasopharynxtissue.

Keywords:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol

鼻咽癌是我國華南地區常見的惡性腫瘤之一，其發生的病因、發病機制以及發生發展也是我們廣東醫學院病理學教研室一直關注和研究的課題。由于鼻咽組織活檢時不易大量取材，且組織中淋巴細胞較多，組織質地較脆，石蠟切片常出現組織碎裂、染色發白、模糊不清、細胞固縮等現象，另外淋巴細胞、網狀細胞表面上的Fc受體及一些反應性淋巴細胞干擾免疫組化的結果，導致制作滿意的鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色較為困難，繼而影響病理診斷及后續的科研工作。為此，我們摸索自己實驗室的工作條件及各種抗體最佳的實驗條件來制定標準化實驗流程，穩定鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色的質量，現報道如下。

1材料與方法

1．1材料來自廣東醫學院附屬醫院臨床送檢的鼻咽標本。

1．2主要儀器輪轉切片機(德國,Leica)、家用高壓鍋(廣州)。

1．3主要試劑p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人單克隆抗體、多克隆抗體及免疫組化染色SP試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、抗體稀釋液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1．4組織切片的制備鼻咽組織離體時立即用生理鹽水輕輕洗去組織上的血液及黏液,隨后即用4%中性緩沖甲醛液固定,并及時送病理科作進一步處理。4%中性緩沖甲醛液固定不宜超過18h。脫水從低濃度乙醇到高濃度乙醇梯度脫水,級差以10%為宜，一般從60%乙醇開始30min,70%乙醇30min,80%乙醇25min,95%乙醇25min,無水乙醇Ⅰ20min,無水乙醇Ⅱ20min;二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min;58℃石蠟浸蠟，期間最好更換1次，浸蠟3h后60℃石蠟包埋制成蠟塊。一次性刀片進行切片，切片厚度為2μm～3μm,40℃以下水溫展片,65℃溫箱烤片1h～4h。

1．5免疫組化染色方法切片烤片后脫蠟至水，然后蒸餾水洗兩次，高壓鍋內放約5cm深的自來水，大火加熱至沸騰，再將檸檬酸鹽緩沖液(200ml～400mlpH)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高溫塑料切片架上放入盛有緩沖液的搪瓷杯中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續中火加熱至噴氣，從噴氣開始記時1min后，壓力鍋離開火源，冷卻至室溫(稍冷后,可在自來水龍頭下流水加速冷卻)，取出切片，先用蒸餾水沖洗兩次之后用PBS(pH～)沖洗，余下按免疫組化步驟選擇不同的抗體進行染色。

2結果

鼻咽切片組織無收縮、開裂，組織結構、細胞形態清晰，鼻咽癌癌細胞及各種炎癥細胞能清晰辨認，HE染色鮮艷，細胞核呈鮮明的藍色,細胞質被伊紅染成深淺不同的粉紅色、桃紅色，核仁呈紅色，對比度良好(見圖1)。免疫組化染色結果為病變組織結構完整、無脫片現象，陽性與陰性對比明顯，陽性物質定位準確；背景干凈、清晰，無非特異性著色(圖2),組織結構與細胞輪廓完整、清晰，染色結果穩定可靠、敏感性高、特異性強、細胞核呈藍色、適合顯微照相等。

圖1鼻咽癌組織(HE400)

圖2Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的強陽性表達(SP400)

3討論

免疫組織化學由于其具有的復雜性，在技術應用過程中存在不少問題，直接或間接地影響了最終的病理診斷，應予以重視以下幾方面，才能從總體上保證鼻咽組織免疫組化染色的質量。

制作優質石蠟切片是做好鼻咽組織免疫組化染色的基礎取材時鼻咽組織上的血液及黏液將影響固定液的滲透和干擾免疫組化染色的結果，而且鼻咽組織由于組織中淋巴細胞比較豐富和致密，間質成分較少是難以制作優質石蠟切片的主要原因，所以組織固定的好壞是影響免疫組化結果的關鍵因素。因此有條件時，鼻咽組織離體時立即用生理鹽水洗去組織上的血液和黏液，并用4%中性緩沖甲醛液固定；或者用4%中性緩沖甲醛液固定后及時送病理科做進一步處理：即輕輕晃動瓶內固定液,利用原有固定液洗去鼻咽組織上的血液及黏液,再換一次4%中性緩沖甲醛液固定。乙醇脫水盡可能從較低濃度起始，以免組織過度收縮。常溫下二甲苯透明時間≤30min，不然組織變脆。制片嚴格按操作程序進行，否則是免疫組化產生假陽性、假陰性或脫片的主要原因。

鼻咽組織蠟塊的管理因為要考慮患者的經濟負擔，經病理確診后的病例做免疫組化染色不普遍，鼻咽組織做免疫組化染色絕大部分是教師或研究生的研究課題需要。為了檔案資料的齊全和避免醫療糾紛，＜2mm組織的蠟塊一般不允許再切片。教師或研究生選擇做免疫組化的鼻咽組織蠟塊要通過觀察HE染色切片的組織形態的基礎上來決定，根據診斷來選擇，不要選擇組織壞死和出血多的蠟塊，所有需要做免疫組化的鼻咽組織切片均由有經驗的專業技術員切片，以防組織蠟塊切削過多。切片完畢后組織蠟塊要及時封蠟歸檔，力求科研工作有延續性和檔案資料的完整性。

免疫組化切片的質量控制要求免疫組化染色使用的玻片必須用飽和的重鉻酸鉀濃硫酸液浸泡3d以上，撈出后用自來水徹底清洗干凈，再經95%乙醇過一遍，晾干后涂防脫片劑烘干備用。裱片時切片片膜不能留有氣泡，烤片時溫度過低、時間過短，則易脫片，溫度過高、時間過長則對抗原有破壞，烤片后用專用二甲苯、乙醇脫蠟至水洗，脫蠟要徹底。我們曾采用微波加熱等方法進行抗原修復，但效果不如高溫高壓抗原修復法理想。另外高溫高壓加熱時間的長短很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在3min內，時間過長，可能會使染色背景加深。檸檬酸緩沖液不能重復使用，且容量必須保證所有切片都能浸泡到，整個染色過程不要讓切片干涸。顯色在鏡下控制，時間約3min～7min，在陽性明確的部位著淡黃色即終止顯色，此時顯色程度較佳，能有效地避免背景著色。蘇木素復染后要充分返藍，否則背景呈紫紅色(見圖3)。

圖3蘇木素復染未充分返藍、背景呈紫紅色

增強特異性著色、降低非特異性染色是免疫組化的質量保證抗體是免疫組織化學最核心的試劑，其質量直接影響免疫組織化學的結果判斷繼而影響診斷，由于鼻咽組織中的淋巴細胞、網狀細胞會產生非特異性染色。因此要選擇特異性強、效價高的一抗，新購進的抗體儲存在4℃冰箱并進行預實驗，摸索出最佳實驗條件。抗體的稀釋包括特異性一抗、中間聯結抗體及標記抗體，其稀釋度與抗體的濃度、質量及有效期、孵育時間和采用的方法等。防止失效的抗體進入實驗室，此外要選擇病變典型的做免疫組化染色對照，一定要每一批免疫組化均設有已知陽性對照和用PBS代替一抗的空白對照。

免疫組織化學結果的判讀結果的判斷免疫組化切片應是陽性標記強而非特異性染色淡或無,兩者形成鮮明的對比,陽性表達必須在細胞或組織特定的部位,細胞邊界清楚;每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結果作出正確判斷。判斷標準常根據陽性細胞的百分比或陽性細胞的染色深度來判斷,其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結果還要結合組織形態學判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應分布總是有規律、局限、定位準確和一定形態特征的,如細胞膜著色呈圓形;典型的細胞核著色為均質狀,核仁和染色質呈顆粒狀著色。

免疫組織化學陽性庫的建立為了保證陽性對照的可靠性，在日常工作中要收集各種抗原的陽性組織和陽性切片，逐步建立陽性對照切片庫及相應的電子檔案庫。如預期結果為陰性或病理形態診斷與免疫組化結果相反時，必須要有陽性對照才能作出正確的病理診斷，陽性對照能說明染色技術和陰性結果的可靠性，不是由于標本處理不當導致的抗原喪失、方法錯誤、技術不熟練等造成的假陰性。鼻咽組織免