一種植物遺傳轉化的新型技術介紹,基因工程論文摘要：農桿菌介導的植物穩定遺傳轉化技術已經在植物基因工程領域得到廣泛應用.本文介紹了一種由農桿菌介導的新型植物遺傳轉化技術發芽種子真空侵染法.應用此方式方法將表示出載體pBI121-HC-Pro轉化到煙草植株中,并優化了農桿菌的濃度及真空侵染的條件.半定量RT-PCR(Reversetranscription-PCR)方式方法檢測結果表示清楚這種轉化方式方法能夠使HC-Pro在煙草中表示出,具有廣泛的應用前景.本文關鍵詞語：新型遺傳轉化技術;發芽種子真空侵染法;半定量RT-PCR;HC-Pro;Abstract：Agrobacterium-mediatedplantstablegenetictransformationtechnologyhasbeenwidelyusedinplantgeneticengineering.Inthispaper,anewtechnologyofplantgenetictransformationmediatedbyAgrobacteriumwasintroduced.ThevectorpBI121-HC-Prointotobaccoplantswastransformedbyusingvacuuminfiltrationofgerminatedseeds,andoptimizedtheconcentrationofAgrobacteriumandtheconditionofvacuuminfiltration.Theresultsofsemi-quantitativeRT-PCRshowedthatHC-Progenecouldbestablyexpressedintobaccoplantsbythetechnology.Thenewtechnologyhasbroadapplicationprospects.Keyword：stabletransformation;vacuuminfiltration;semi-quantitativeRT-PCR;helpercomponent-proteinase;隨著植物基因工程的迅速發展,植物遺傳轉化的方式方法越來越多樣,例如農桿菌介導法、基因槍法、超聲波法、電轉化法和花粉管通道法等多種方式方法,華而不實農桿菌介導的轉基因方式方法是當前植物遺傳轉化的重要方式方法之一[1].農桿菌介導的植物遺傳轉化中,葉盤轉化法以轉化效率高,轉化穩定等優點,應用最為廣泛.葉盤轉化法也存在眾多問題,如轉化周期長,需培養經過較為復雜,而且有一定的的污染率,及由激素[2,3]、陽離子[4]、培養環境[5]等導致的畸形苗和玻璃化問題[6].蚜傳輔助因子HC-Pro(helpercomponent-proteinase)是一種RNA沉默抑制子[7],是由煙草蝕紋病毒(TEV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)編碼的[8].可抑制植物的基因沉默,反式激活其他病毒的復制,加強其致病性,使其他病毒的危害加重,植物病毒間的協生作用就是由此引起的[9].HC-Pro蛋白能通過阻止21-24ntsiRNA的構成或干擾siRNA的穩定性在抵抗宿主的基因沉默效應中起作用[10,11],其抵御外源基因和病毒的入侵,并且保持本身基因組穩定[12,13].基因沉默效應廣泛的存在于植物生長發育的各個階段[14],已有實驗證明HC-Pro蛋白在馬鈴薯Y病毒屬相關的協同作用中起著重要作用[15].本文中介紹了一種植物遺傳轉化的新型技術,利用煙草的發芽種子真空侵染法獲得轉基因煙草,通過半定量RT-PCR鑒定檢測到HC-Pro的表示出.并對這種新技術進行了優化實驗,以提高外源基因的表示出效率,為我們進行HC-Pro蛋白的功能研究奠定了實驗基礎.1、實驗材料1.1、植物材料與表示出載體野生型煙草(NicotianabenthamianaL.)和DH5a,EHA105等菌種為本實驗室保存,表示出載體pBI121-HC-Pro由本實驗室成員構建.1.2、實驗試劑反轉錄試劑盒、La-Taq等酶試劑購自大連寶生物;各種試劑、藥品購于北京鼎國生物公司.2、實驗方式方法2.1、發芽種子培養及菌液的準備煙草種子用30%的84消毒液進行消毒,消毒時間為10min,再用無菌水清洗3次后播種在MS固體培養基上,光照培養箱中培養2d.煙草種子發芽時,準備侵染.取構建成功的帶有表示出載體和目的基因的農桿菌菌種,將1mL菌種活化在5mLLB參加5LKana霉素母液和5L福利平母液的培養液中,28℃條件下,180rpm過夜培養.次日,擴搖100mLLB,按比例參加抗生素,并參加乙酰丁香酮40L/100mL,菌液OD600值到達0.6～1.0時備用.2.2、煙草發芽種子的真空侵染菌液在5000rpm條件下離心10min,倒掉上清液后用配制好的100mLMMA溶液重懸收集的菌體,室溫避光放置1～3h待用.將重懸的菌液倒入培養皿中,約20mL,放入已發芽的煙草種子,分別在不同壓力條件下(0.05、0.06、0.07、0.08MPa),抽真空3min.清水沖洗后移栽到花盆中,覆蓋黑色塑料袋避光1d.繼續培養幼苗7～15d后觀察轉基因植物表型并鑒定.2.3、轉HC-Pro基因的煙草植株的RT-PCR鑒定為檢測轉基因植株中的目的基因能否在轉錄水平上得到表示出,我們采用RT-PCR的方式方法對侵染后的植株進行檢測.利用Trizol法提取植物總RNA,用30L滅菌的ddH2O進行RNA溶解.總RNA樣品進行預變性,參加反轉錄酶及反轉錄酶緩沖液和RNA酶抑制劑進行反轉錄反響獲得cDNA,42℃60min后置于冰上;取2LcDNA為模板進行PCR擴增和電泳檢測.3、結果與分析3.1轉HC-Pro基因的煙草植株差異表型的觀察播種后兩天的煙草發芽種子并且抽出子葉節時進行侵染,真空侵染后的發芽種子栽種到土壤生長中.生長經過中逐步有部分幼苗較弱小甚至死亡現象.成活的煙草有植株生長緩慢、細弱的特點,栽種后15d左右,植株有葉片蜷縮不舒展葉緣不規則缺刻(如此圖1(A)),轉基因苗出現葉片嚴重蜷曲變形的表型(如此圖1(B)),并且伴隨部分株系敗育的現象.子代轉基因煙草植株葉片與野生型植株煙草葉片比照后發現,轉基因煙草子代植株與野生型煙草的株型差異不大但是其葉片仍有卷曲缺刻的現象.圖1HC-Pro轉基因煙草植株表型(A)侵染后的煙草幼苗;(B)栽種后有明顯表型特征的轉基因煙草苗3.2、HC-Pro轉基因煙草及子代的RT-PCR鑒定利用發芽種子抽真空的方式方法將表示出載體p35S-HC-Pro轉化到煙草植株中,我們獲得了大量HC-Pro轉基因煙草;并對這些轉基因植株進行了轉錄水平的檢測.選取有轉基因表型的植株,進行RT-PCR檢測分析.結果表示清楚:被檢測的植株中HC-Pro獲得較高水平的表示出(如此圖2(A)),重復檢測結果與其一致,如此圖2(B)所示.圖2轉基因植株中HC-Pro基因的表示出檢測(A)RT-PCR檢測HC-Pro基因的表示出;(B)HC-Pro基因的重復檢測結果4、討論農桿菌介導的植物侵染和基因表示出研究的已經較為深切進入[16,17,18,19].實驗中農桿菌的菌液濃度和侵染壓力是使目的基因成功轉化的主要影響條件[20,21,22].我們設置農桿菌在MMA重懸溶液中的OD600,分別為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2,對發芽的煙草種子進行侵染.結果表示清楚:在OD600為0.4時轉化效率過低,當OD600為1.2時會使煙草幼苗的死亡率升高;最適宜的農桿菌重懸液濃度范圍為OD600=0.6～1.0,能夠有效提高轉化的效率.除此之外,我們對真空侵染的壓力條件進行了優化實驗,分別設置不同的壓力:0.04、0.05、0.06、0.07、0.08MP,不同的壓力梯度下進行侵染,并觀察植物表型.結果表示清楚在0.06MP壓力下,適當增加抽真空次數能夠到達有效侵染的目的.但更多地實驗條件的優化還需要進一步的研究.以下為參考文獻[1]姚冉,石美麗,潘沈元,等.農桿菌介導的植物遺傳轉化研究進展[J].生物技術進展,2018,1(4):260-265.[2]KATAEVANV,ALEXANDROVAIG,BUTENKORG,etal.Effectofappliedandinternalhormonesonvitrificationandapicalnecrosisofdifferentplantsculturedinvitro[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,1991,27(2):149-154.[3]KADOTAM,NIIMIY.Effectsofcytokinintypesandtheirconcentra-tionsonshootproliferationandhyperhydricityinvitropearcultivarshoots[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2003,72(3):261-265.[4]MONSALUDMJ,MATHEWSH,LITZRE,etal.Controlofhyperhydricityofmangosomaticembryos[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,1995,42(2):195-206.[5]SAHERS,PIQUERASA,HELLINE,etal.Preventionofhyperhydricityinmicropropagatedcarnationshootsbybottomcooling:implicationsofoxidativestress[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2005,81(2):149-158.[6]亓建飛,李付廣,張朝軍,等.植物組織培養中畸形苗發生機理的研究進展[J].棉花學報,2004,16(4):243-248.[7]ANANDALAKSHMIR,PRUSSGJ,GEX,etal.Aviralsuppressorofgenesilencinginplants[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(22):13079-13084.[8]BRIGNETIG,etal.ViralpathogenicitydeterminantsaresuppressorsoftransgenesilencinginNicotianabenthamiana[J].EmboJ,1998,17(22):6739-46.[9]李向東,李懷方,范在豐,等.馬鈴薯Y病毒屬病毒HC-Pro研究進展[J].山東農業大學學報(自然科學版),2000,31(4):437-440.[10]蔣琳,魏春紅,李毅.病毒基因沉默抑制子及其作用機制[J].中國科學,2020,42(1):16-28.[11]VANCEVB,ANANDALAKSHMIR,PRUSSGJ,etal.Aviralsuppressorofgenesilencinginplants[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95:13079-13084.[12]BOUTETS,VAZQUEZF,LIUJ,etal.ArabidopsisHEN1:AgeneticlinkbetweenendogenousmiRNAcontrollingdevelopmentandsiRNAcontrollingtransgenesilencingandvirusresistance[J].CurrBiol,2003,13(10):843-848.[13]HANMH,GOUDS,SONGL,etal.TheArabidopsisdouble-strandedRNA-bindingproteinHYL1playsaroleinmicroRNA-mediatedgeneregulation[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,10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