色譜法的理論與實踐11/23/20221色譜法的理論與實踐11/22/20221一、色譜基礎理論概述色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學的分離分析方法。1906年俄國植物學家TswettM將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。11/23/20222一、色譜基礎理論概述色譜法或稱層析法（chromatogra色譜法是利用物質在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達到分離。色譜技術在近二十多年中的飛速發展已形成一門專門的科學，稱為色譜學。廣泛應用于各個領域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。11/23/20223色譜法是利用物質在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異二、色譜法的分類

按流動相與固定相的分子聚集狀態分類按流動相的分子聚集狀態分類GC，LC，超臨界流體色譜（SFC）按固定相的聚集狀態分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配11/23/20224二、色譜法的分類按按色譜過程的分離機制分類

吸附色譜（adsorption~）利用吸附能力的差別.分配色譜（partition~）利用分配系數的差別.空間（分子）排阻色譜（stericexclusion~）或稱凝膠色譜法（gel~）利用被測物分子大小不同而導致的滲透系數差異.11/23/20225按色譜過程的分離機制分類吸附色譜（adsorption~離子交換色譜（ionexchange~）利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacidanalysis）離子色譜法（ionchromatography）親合色譜（affinity~）將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進行分離(專用于蛋白質等生化樣品）。11/23/20226離子交換色譜（ionexchange~）11/22/20毛細管電色譜（capillaryelectro-~）依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數和電泳速度差別而分離。毛細管電泳（capillaryelectrophoresis）以高壓電場為驅動力，根據樣品組分的淌度和分配系數而分離。手性色譜（chiralchromatography）利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。11/23/20227毛細管電色譜（capillaryelectro-~）11填充柱毛細管柱毛細管電色譜毛細管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC

LCSFCCEC色譜法經典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法11/23/20228填充柱毛細管電色譜柱色譜GC色譜法經典液相色譜紙色譜法11/熱力學理論——塔片理論是由平衡的觀點來研究分離過程，是一種半經驗理論，以塔片理論為代表。動力學理論——速率理論是從動力學觀點，即速度來研究各種動力學因素對柱效的影響，以VanDeemeter方程式為代表。三、色譜理論

11/23/20229熱力學理論——塔片理論三、色譜理論11/22/20基本概念色譜峰（peak）——樣品產生的電信號強度對洗脫時間作圖。稱為流出曲線，濃度-時間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202210基本概念11/22/202210峰形參數：對稱因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）來衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202211峰形參數：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的對稱性hABd1xW0.05h11/23/202212W0.05h=x=h/20峰的對稱性hA一個色譜峰，可用三項參數來描述：峰高或峰面積——定量峰位（保留值）——定性峰寬——衡量柱效峰面積(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202213一個色譜峰，可用三項參數來描述：峰面積(A)峰高(h)t基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流動相通過時的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時間的變化。噪音（noise，N）——各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移掌握11/23/202214基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流定性參數保留值保留時間，保留體積相對保留值保留指數11/23/202215定性參數11/22/202215保留值保留時間（retentiontime，tR）——進樣開始到組分色譜峰頂點時間間隔。死時間（deadtime，t0或tM）——流動相通過色譜系統的時間。11/23/202216保留值11/22/202216調整保留時間（adjustedretentiontime，t’R）也稱為表觀保留時間、校正保留時間——某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間，即：t’R=tR－t0，在實驗條件一定（溫度、固定相），t’R決定組分的性質，故t’R是定性的基本參數。11/23/202217調整保留時間（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進樣11/23/202218t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進保留體積（retentionvolume，VR），又稱洗脫體積——流動相攜帶樣品進入色譜柱，由進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時，通過色譜柱的流動相體積。

11/23/202219保留體積（retentionvolume，VR），又稱相對保留值（1,2)——指組分（1）與參照物（2）兩者調整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K為分配系數）保留指數（I，Kovats指數）——是把組分的保留行為換算成相當于含有幾個碳的正構烷烴的保留行為來描述。11/23/202220相對保留值（1,2)保留指數（I，Kovats指數）11/柱效率的參數（色譜峰的區域寬度）標準差（，standarddeviation)半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202221柱效率的參數（色譜峰的區域寬度）熟悉11/22/202221標準差——在正態分布曲線中，將x=±1處（拐點）的峰寬之半稱為標準偏差。在實際工作中,標準差為峰高0.607h處的峰寬之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0時，曲線的高度為峰高h11/23/202222標準差——在正態分布曲線中，將x=±1處（拐點）的峰寬之半稱半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355，W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/211/23/202223半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側的拐點作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以：W=4W11/23/202224峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側的拐點作切線,在極限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202225Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系數（partitioncoefficient，K）

在一定條件下，達到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃度（Cs）樣品組分在流動相中的濃度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202226分配系數（partitioncoefficient，K）分離參數分離參數用于衡量分離條件的優劣，常用分離度，表示。分離度（resolution，R）R=即相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬[(W1+W2)/2]的幾倍。R大,分離效果好。2（tR2-tR1）W1+W211/23/202227分離參數2（tR2-tR1）W1+W211/22/20R=0.5tR2-tR1=2，稱為2分離。分離后各峰露出的面積≥68.3%R=1.0稱為4（峰頂間距為4），兩峰峰基略有重疊，裸露峰面積≥95.4%R=1.5tR2-tR1=6，稱為6分離（峰頂間距為6），分離后各峰露出的面積≥99.7%R﹥1.5R﹥1.5，稱為完全分離11/23/202228R=0.5tR2-tR1=2，稱為2分離。分離后各峰露出塔板理論把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內，樣品混合物在氣液兩相中達到分配平衡，經多次分配平衡后，分配系數小的組分，先到達塔頂（先流出色譜柱）。由于色譜柱的塔板相當多，因此分配系數的微小差別就可獲得很好的分離效果。在柱內一小段長度H內（相當于一個分餾塔），組分可以很快在兩相間達到平衡，H稱為理論塔板高度。11/23/202229塔板理論11/22/202229理論板數（n）與理論板高度（H）

n=（tR/）2n=5.54（tR/w1/2）2n=16(tR/w)2n越大，柱效越高。如果用t’R計算理論板數，所得值為有效理論板數n有效11/23/202230理論板數（n）與理論板高度（H）11/22/202230理論板數取決于：固定相種類、性質、填充狀況、柱長；流動相及其流速；被測物性質等。理論板高(H)H=L/nL為色譜柱長度，當L一定時，H與n呈反比，即H越小，柱效越高。11/23/202231理論板數取決于：11/22/202231速率理論速率理論是把色譜過程看作一個動態過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬的影響。氣相色譜——VanDeemeter方程式HPLC速率方程式——Giddings方程式11/23/202232速率理論11/22/202232重點：1.色譜理論2.色譜分類方法3.主要術語概念：11/23/202233重點：11/22/202233色譜法的理論與實踐11/23/202234色譜法的理論與實踐11/22/20221一、色譜基礎理論概述色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學的分離分析方法。1906年俄國植物學家TswettM將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。11/23/202235一、色譜基礎理論概述色譜法或稱層析法（chromatogra色譜法是利用物質在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達到分離。色譜技術在近二十多年中的飛速發展已形成一門專門的科學，稱為色譜學。廣泛應用于各個領域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。11/23/202236色譜法是利用物質在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異二、色譜法的分類

按流動相與固定相的分子聚集狀態分類按流動相的分子聚集狀態分類GC，LC，超臨界流體色譜（SFC）按固定相的聚集狀態分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配11/23/202237二、色譜法的分類按按色譜過程的分離機制分類

吸附色譜（adsorption~）利用吸附能力的差別.分配色譜（partition~）利用分配系數的差別.空間（分子）排阻色譜（stericexclusion~）或稱凝膠色譜法（gel~）利用被測物分子大小不同而導致的滲透系數差異.11/23/202238按色譜過程的分離機制分類吸附色譜（adsorption~離子交換色譜（ionexchange~）利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacidanalysis）離子色譜法（ionchromatography）親合色譜（affinity~）將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進行分離(專用于蛋白質等生化樣品）。11/23/202239離子交換色譜（ionexchange~）11/22/20毛細管電色譜（capillaryelectro-~）依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數和電泳速度差別而分離。毛細管電泳（capillaryelectrophoresis）以高壓電場為驅動力，根據樣品組分的淌度和分配系數而分離。手性色譜（chiralchromatography）利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。11/23/202240毛細管電色譜（capillaryelectro-~）11填充柱毛細管柱毛細管電色譜毛細管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC

LCSFCCEC色譜法經典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法11/23/202241填充柱毛細管電色譜柱色譜GC色譜法經典液相色譜紙色譜法11/熱力學理論——塔片理論是由平衡的觀點來研究分離過程，是一種半經驗理論，以塔片理論為代表。動力學理論——速率理論是從動力學觀點，即速度來研究各種動力學因素對柱效的影響，以VanDeemeter方程式為代表。三、色譜理論

11/23/202242熱力學理論——塔片理論三、色譜理論11/22/20基本概念色譜峰（peak）——樣品產生的電信號強度對洗脫時間作圖。稱為流出曲線，濃度-時間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202243基本概念11/22/202210峰形參數：對稱因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）來衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202244峰形參數：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的對稱性hABd1xW0.05h11/23/202245W0.05h=x=h/20峰的對稱性hA一個色譜峰，可用三項參數來描述：峰高或峰面積——定量峰位（保留值）——定性峰寬——衡量柱效峰面積(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202246一個色譜峰，可用三項參數來描述：峰面積(A)峰高(h)t基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流動相通過時的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時間的變化。噪音（noise，N）——各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移掌握11/23/202247基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流定性參數保留值保留時間，保留體積相對保留值保留指數11/23/202248定性參數11/22/202215保留值保留時間（retentiontime，tR）——進樣開始到組分色譜峰頂點時間間隔。死時間（deadtime，t0或tM）——流動相通過色譜系統的時間。11/23/202249保留值11/22/202216調整保留時間（adjustedretentiontime，t’R）也稱為表觀保留時間、校正保留時間——某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間，即：t’R=tR－t0，在實驗條件一定（溫度、固定相），t’R決定組分的性質，故t’R是定性的基本參數。11/23/202250調整保留時間（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進樣11/23/202251t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進保留體積（retentionvolume，VR），又稱洗脫體積——流動相攜帶樣品進入色譜柱，由進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時，通過色譜柱的流動相體積。

11/23/202252保留體積（retentionvolume，VR），又稱相對保留值（1,2)——指組分（1）與參照物（2）兩者調整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K為分配系數）保留指數（I，Kovats指數）——是把組分的保留行為換算成相當于含有幾個碳的正構烷烴的保留行為來描述。11/23/202253相對保留值（1,2)保留指數（I，Kovats指數）11/柱效率的參數（色譜峰的區域寬度）標準差（，standarddeviation)半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202254柱效率的參數（色譜峰的區域寬度）熟悉11/22/202221標準差——在正態分布曲線中，將x=±1處（拐點）的峰寬之半稱為標準偏差。在實際工作中,標準差為峰高0.607h處的峰寬之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0時，曲線的高度為峰高h11/23/202255標準差——在正態分布曲線中，將x=±1處（拐點）的峰寬之半稱半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355，W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/211/23/202256半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側的拐點作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以：W=4W11/23/202257峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側的拐點作切線,在極限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202258Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系數（partitioncoefficient，K）

在一定條件下，達到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃度（Cs）樣品組分在流動相中的濃度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202259分配系數（partitioncoefficient，K）分離參數分離參數用于衡量分離條件的優劣，常用分離度，