第2節基因工程的基本操作程序第1課時獲取目的基因與構建基因表達載體第三章內容索引0102基礎落實?必備知識全過關重難探究?能力素養全提升課程標準1.運用系統思想解釋基因工程的基本步驟和原理。2.基于細胞內DNA復制的原理,闡明PCR的原理,說出PCR所需的條件及其反應過程。3.結合模式圖說出基因表達載體的組成,并理解構建目的。基礎落實?必備知識全過關知識點一目的基因的篩選與獲取1.培育轉基因抗蟲棉的四個步驟目的基因的__________→____________________的構建→將目的基因導入__________→目的基因的__________。

2.篩選合適的目的基因(1)從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選。(2)應用測序技術、序列數據庫、序列比對工具等認知更多的基因結構和功能,以便找到合適的目的基因。篩選與獲取

基因表達載體

受體細胞

檢測與鑒定

3.利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的目的:在體外對目的基因的核酸序列進行大量復制。(2)PCR原理:____________________。

(3)PCR條件:一定的緩沖溶液、__________、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸和____________________酶。

分別與兩條模板鏈結合,使DNA聚合酶能夠從引物的3

'端開始連接脫氧核苷酸聚合酶鏈式反應

DNA半保留復制

DNA模板

耐高溫的DNA聚合

(4)每次循環的過程:變性→復性→延伸。①變性:當溫度超過90℃時,____________________。

②復性:冷卻至__________℃左右時,兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。

③延伸:加熱至72℃左右時,4種脫氧核苷酸在耐高溫的____________的作用下,根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。

(5)特點:上一輪循環的產物作為下一輪反應的__________,每一次循環后,目的基因的量可以__________,即成指數形式擴增(約為2n,n為擴增循環的次數)。

(6)鑒定:常用____________________來鑒定PCR的產物。

打開DNA雙鏈

雙鏈DNA解聚為單鏈

50DNA聚合酶

模板

增加一倍

瓊脂糖凝膠電泳

旁欄邊角想一想用PCR技術可以擴增mRNA嗎?結論語句辨一辨1.PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應。(

)2.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。(

)3.PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶。(

)4.PCR過程中需要模板DNA和一個引物分子。(

)提示

mRNA不可以直接擴增,需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。

×√××知識點二基因表達載體的構建1.基因表達載體的構建目的使目的基因在受體細胞中__________,并且可以遺傳給下一代,同時,使目的基因能夠__________和__________。

2.基因表達載體的組成穩定存在

表達

發揮作用

啟動子

上游

RNA聚合酶轉錄終止子下游轉錄標記目的基因3.基因表達載體的構建過程(1)首先用一定的__________切割載體。

(2)然后用__________限制酶或能產生__________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

(3)再利用__________將目的基因片段拼接到載體的切口處。

旁欄邊角想一想將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎?如果這么做,效果會怎樣?限制酶

同種

相同末端

DNA連接酶

提示

采用總DNA注射法進行遺傳轉化,即將一個生物的總DNA提取出來,不進行基因表達載體的構建,通過注射等方法導入受體植物。這種方法針對性差,無法確定哪些基因導入了受體植物。結論語句辨一辨1.表達載體的復制和目的基因的表達均啟動于復制原點。(

)2.外源DNA必須位于重組質粒的啟動子上游或終止子的下游才能進行表達。(

)3.基因表達載體中需要含有起始密碼、終止密碼、目的基因、標記基因。(

)4.借助抗生素抗性基因可將含目的基因的受體細胞篩選出來。(

)×××√重難探究?能力素養全提升主題一目的基因的篩選與獲取【情境探究】

在基因工程中,目的基因是用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。目的基因主要是指編碼蛋白質的基因。請結合教材“目的基因的篩選與獲取”相關內容,回答下列問題。1.獲取目的基因的方法有哪些?提示

人工合成目的基因;用PCR特異性地快速擴增目的基因;通過構建基因文庫來獲取目的基因。2.現在常用PCR技術特異性地快速擴增目的基因。(1)PCR反應需要與兩條模板鏈結合的引物,什么是引物?提示

引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。(2)某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖),請分別說明理由。提示

第1組的引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效。第2組中引物Ⅰ'自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效。(3)如果PCR循環n次,則共需消耗多少對引物?提示

共需消耗2n-1對引物。【方法突破】

細胞內DNA復制與PCR技術的比較

比較項目細胞內DNA復制PCR技術區別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解聚場所主要在細胞核內PCR擴增儀(PCR儀)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶溫度細胞內溫和條件控制溫度,在不同溫度下進行結果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯系(1)模板:均需要脫氧核苷酸單鏈作為模板(2)原料:均為4種脫氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成

2種引物的作用【視角應用】

1.(2021山東聊城高二期中)下列有關PCR技術的敘述,錯誤的是(

)A.PCR技術的原理是DNA半保留復制B.變性過程中破壞的是磷酸二酯鍵C.復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成的D.延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸等,無須添加ATPB解析

PCR技術根據DNA半保留復制的原理,將基因的核苷酸序列不斷地加以復制,使其數量呈指數增加,A項正確;變性過程中目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,破壞的是氫鍵,B項錯誤;引物是一段目的基因已知的核苷酸序列,復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成的,C項正確;延伸過程中需要模板DNA、四種dNTP、耐高溫的DNA聚合酶等,無須添加ATP,D項正確。2.(2021山東師大附中高二期中)通過設計引物,運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變。如圖為獲取突變基因的過程,其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對,但不影響引物與模板鏈的整體配對,反應體系中引物1和引物2的5'端分別設計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關敘述錯誤的是(

)A.引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入B.復性溫度過高會導致引物不能與模板鏈牢固結合,PCR擴增效率下降C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因D.第3輪PCR結束后,含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2D解析

引物中設計兩種限制酶識別位點,可以配合載體的限制酶識別位點,幫助目的基因定向定點插入載體,避免發生自身環化,A項正確;PCR技術中,復性是指引物結合到互補DNA鏈,復性溫度過高會引起堿基之間的氫鍵斷裂,導致引物不能與互補DNA鏈(模板鏈)牢固結合,DNA擴增效率下降,B項正確;第3輪PCR,引物1能與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因,C項正確;第3輪PCR結束后,含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA只有1個,而子代DNA有23=8(個),故含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/8,D項錯誤。主題二基因表達載體的構建【情境探究】

構建基因表達載體是基因工程的核心步驟。目的是讓基因在受體細胞中穩定存在,并且遺傳給下一代;同時,使目的基因能夠表達和發揮作用。請討論回答下列問題。1.通過PCR技術獲取足夠量的目的基因后,能直接導入受體細胞嗎?為什么?提示

不能。若將目的基因直接導入受體細胞,目的基因可能被受體細胞分解或無法隨細胞分裂進行復制,不能穩定遺傳和表達。2.作為基因表達載體,需要包含哪些功能原件?啟動子、終止子和起止密碼子和終止密碼子的化學本質是否相同?提示

基因工程表達載體需要包含目的基因、標記基因、啟動子、終止子等功能原件。啟動子和終止子位于DNA上,是DNA上的堿基序列;起止密碼子和終止密碼子是mRNA上的堿基序列。3.下圖1、2分別表示載體和目的基因及其上的限制酶的切割位點。(1)據圖分析,構建基因表達載體時,能否用限制酶SmaⅠ切割質粒?為什么?提示

不能。因為SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因。質粒上的抗性基因是標記基因,便于重組DNA分子的篩選,若被破壞,無法進一步篩選。(2)與只使用EcoRⅠ相比較,使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點是什么?提示

可以防止質粒和目的基因的自身環化以及目的基因與載體的反向連接。【方法突破】

1.區分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子:啟動子和終止子位于DNA上,是基因表達載體必需的部分,而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,決定翻譯的開始和結束。2.圖解限制酶的選擇原則

(1)不破壞目的基因原則:如圖甲中可選擇PstⅠ,而不選擇SamⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則:所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構,如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現相同黏性末端原則:通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒,如圖中PstⅠ;為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒,如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。【視角應用】

1.(2021江蘇揚州中學高二月考)下面是利用基因工程技術培育轉基因植物,進而生產可食用疫苗的部分過程示意圖,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內切核酸酶。下列說法錯誤的是(

)A.圖示過程是基因工程的核心步驟B.表達載體構建時需要用到限制酶SmaⅠC.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來D.除圖示組成外,表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構B解析

圖示過程為基因表達載體的構建過程,是基因工程中的核心步驟,A項正確;構建表達載體過程中需要將目的基因完整切割下來,此時要用到限制酶Pst

Ⅰ、EcoR

Ⅰ,B項錯誤;抗卡那霉素基因是標記基因,目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞,C項正確;基因表達載體應包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因等結構,D項正確。2.(2021山東棗莊高二期中)如圖所示為某質粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的該基因與該質粒構建重組質粒,則擴增的該基因兩端需分別引入哪兩種限