1、試管動物與克隆動物課件試管動物與克隆動物課件試管動物與克隆動物課件第十二章 動物克隆技術第十二章 動物克隆技術精卵結合胚 胎細胞分化個 體精卵結合胚 胎細胞分化個 體基本概念克隆（clone）: 遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體，也指通過克隆方式生產克隆群體的過程或手段。分子克隆細胞克隆個體克隆克隆基本概念克隆（clone）: 遺傳上完全相同的分子、細胞或來基本概念動物克隆：由一個動物經無性繁殖（asexual reproduction）或孤雌生殖而產生的多個后代，克隆的所有成員在遺傳組成上都是完全相同的。細胞核移植技術（nuclear transfer）：動物

2、克隆的核心技術基本概念動物克隆：由一個動物經無性繁殖（asexual re主要內容12.1 動物克隆的研究歷史12.2 動物克隆的意義12.3 動物克隆的原理及技術路線12.4 動物克隆的方法12.5 動物克隆的影響因素12.6 動物克隆技術的應用及發展前景主要內容12.1 動物克隆的研究歷史12.1 動物克隆的研究歷史1938年：德國胚胎學家Spemann首次提出克隆的設想。 1952年：Briggs和Kings獲得豹蛙胚胎克隆后代。1975年：Bromhall最早在家兔上證實哺乳動物的胚胎細胞核移植是可行的。1997年：英國羅斯林研究所宣布克隆羊培育成功。他們用取自一只6歲成年羊的乳腺細胞

3、培育成功一只克隆羊。Wilmut I et al. Nature, 1997, 385: 810-81312.1 動物克隆的研究歷史1938年：德國胚胎學家Spem克隆蛙產生過程克隆蛙產生過程克隆羊產生過程克隆羊產生過程中國克隆動物研究大事記60年代，生物學家童第周對金魚、鯽魚進行細胞核移植。 1990年5月，西北農業大學畜牧所克隆一只山羊。 1992年，江蘇農科院克隆一只兔子。 1993年，中科院發育生物學研究所與揚州大學農學院合作，克隆一只山羊。1995年7月，華南師大與廣西農大合作，克隆一頭奶牛、黃牛雜種牛。 1995年10月，西北農大克隆6頭豬。 1996年12月，湖南醫大克隆6只老鼠

4、。中國農科院畜牧所克隆一頭公牛犢。(以上為胚胎細胞克隆研究) 1997年3月，陳大元率先提出了克隆大熊貓的設想。 1999年，中科院動物研究所成功培育出了大熊貓的早期胚胎。2000年6月，西北農林科技大學培育出世界上第一例成年體細胞克隆山羊。 中國克隆動物研究大事記60年代，生物學家童第周對金魚、鯽魚進12.2 動物克隆的意義體細胞與胚胎干細胞的關系胚胎干細胞體細胞12.2 動物克隆的意義體細胞與胚胎干細胞的關系胚胎干細胞體對傳統動物繁殖模式的挑戰；對社會倫理的挑戰；保存物種、延續生命、提高人口素質？12.2 動物克隆的意義對傳統動物繁殖模式的挑戰；12.2 動物克隆的意義12.3 動物克隆的

5、原理及技術路線胚胎分割的原理胚胎細胞核移植的原理體細胞核移植的原理12.3.1 動物克隆的原理12.3 動物克隆的原理及技術路線胚胎分割的原理12.3.1(1) 胚胎分割的原理大多數哺乳動物的胚胎發育是調整發育。隨著胚胎發育的進行，其調整能力逐漸減弱，細胞的組織發育方向慢慢得到固定，直至調整能力完全喪失。(1) 胚胎分割的原理大多數哺乳動物的胚胎發育是調整發育。(2) 胚胎細胞核移植的原理早期胚胎細胞具有全能性，它包含個體的全套遺傳信息。(2) 胚胎細胞核移植的原理早期胚胎細胞具有全能性，它包含個(3) 體細胞核移植的原理細胞全能性是細胞核基因在不斷變化和胞質環境的作用下有次序、有系統地表達的

6、結果，在分化的細胞內存在有可逆性修飾的遺傳物質。已分化的體細胞在特定條件下，經過去分化也具有全能性，其前提條件是這種細胞在體外進行誘導進入休眠狀態。(3) 體細胞核移植的原理細胞全能性是細胞核基因在不斷變化和12.3 動物克隆的原理及技術路線12.3.2 動物克隆的技術路線12.3 動物克隆的原理及技術路線12.3.2 動物克隆的技試管動物與克隆動物課件12.4 動物克隆的方法 (1) 胚胎細胞核移植的操作程序核供體細胞的獲得受體細胞的選擇及去核核卵重組細胞融合與激活重構胚的培養與移植12.4 動物克隆的方法 (1) 胚胎細胞核移植的操作程序核12345切開卵母細胞透明帶擠出卵母細胞細胞核注入

7、供體細胞核電融合儀融合培養12345切開卵母細胞透明帶擠出卵母細胞細胞核注入供體電融合(1) 胚胎細胞核移植的操作方法 核供體細胞的獲得選擇： 核供體細胞必須具有供體動物完整的基因組，二倍體 能在細胞質的作用下，產生細胞分化過程的倒轉來源： 胚胎細胞，胚胎干細胞，體細胞等(1) 胚胎細胞核移植的操作方法 核供體細胞的獲得 受體細胞的選擇及去核選擇： 成熟的卵母細胞，受精卵，2細胞胚胎來源： 一是用激素進行超排，沖出MII卵母細胞； 二是從屠宰場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘-卵母細胞復合體（COC），體外成熟培養。去核： 盲吸法，半卵法，離心去核法，切割去核法，化學誘導去核，顯微手術法(1) 胚胎

8、細胞核移植的操作方法 受體細胞的選擇及去核(1) 胚胎細胞核移植的操作方法 核卵重組 帶下移植 胞質內注射 細胞融合與激活 細胞融合：仙苔病毒法，電融合法 激活：原理是通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從MII期中解放出來，并轉到“受精”的狀態。(1) 胚胎細胞核移植的操作方法 核卵重組(1) 胚胎細胞核移植的操作方法(1) 胚胎細胞核移植的操作方法重構胚的培養與移植 重組胚移入中間受體或體外培養，觀察其發育率 重組胚移植的受體母體要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的品種、同期發情處理(1) 胚胎細胞核移植的操作方法重構胚的培養與移植(2) 體細胞核移植的操作方法核供體細

9、胞的獲得受體細胞的選擇及去核核卵重組細胞融合與激活重構胚的培養與移植G0期的誘導(2) 體細胞核移植的操作方法核供體細胞的獲得受體細胞的選擇 Creating Dolly！1997年2月22日，英國“Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。 (3) 克 隆 動 物 的 鑒 定對于體細胞核移植的后代，既要從形態、性別上鑒定供體細胞與克隆后代的親緣關系，又要分子生物學水平鑒定DNA 指 紋 ：指每個個體所特有的基因多態性鑒定方法：RAPD 微衛星 RFLP DOLLY的鑒定：微衛星 (3) 克 隆 動 物 的 鑒 定12.5 動物克隆的影響

10、因素供體細胞核的選擇胚細胞的分離和注入卵母細胞去核效果受體胞質的成熟程度及其激活能力核質相互作用與細胞周期同步化重組胚的培養及發育重組胚的妊娠率 影響核移植的主要因素12.5 動物克隆的影響因素供體細胞核的選擇 影響核移植的主12.6.1 核移植的應用 在科研基礎領域方面的應用：促進胞質關系的研究；促進人類了解生物生長發育的機理。 在醫學領域的應用價值：細胞治療；異種器官移植；生產治療性蛋白；培育各種疾病動物模型。 在畜牧業方面的應用：大量繁殖優良個體，提高畜產品產量和質量；克隆技術是培育畜禽優良品種的捷徑；性別控制 保護、挽救瀕危物種12.6 動物克隆技術的應用及發展前景12.6.1 核移植

11、的應用 在科研基礎領域方面的應用：促進核移植 消除免疫排斥 胚胎干細胞 提供細胞來源 面臨的問題 解決方法 細胞來源 尸源性 異種細胞 免疫排斥 免疫抑制劑 基因敲除 免疫隔離(1) 細 胞 治 療核移植 (2) 異 種 器 官 移 植可移植器官短缺豬的器官大小、結構和功能上與人體器官相近急性免疫排斥反應基因敲除半乳糖基轉移酶 核移植 器官移植(2) 異 種 器 官 移 植可移植器官短缺豬的器官大小、（3） 生 產 藥 用 蛋 白 目 的 基 因 轉基因細胞系基 因 打 靶 核 移 植動 物 乳 腺 乳液提取目的產物（3） 生 產 藥 用 蛋 白 目 的 基 因 （4） 培 育 各 種 疾 病

12、 動 物 模 型應用核移植技術可以培育基因完全一致的實驗動物模型 ，為遺傳學，病理學研究提供良好的實驗材料。 動物種類 疾病模型數 豬 65 貓 123 狗 203（4） 培 育 各 種 疾 病 動 物 模 型應用核移植研 究 實 例1997 年底,英國Roslin 研究所和PPL 公司通過克隆轉基因體細胞，獲得了6只整合neo 或neo 和F2IX 基因綿羊,這標志著核移植介導的轉基因技術成功問世。2000 年,英國PPL公司將人AAT 基因定點整合到胎兒成纖維細胞的1 原膠原( Procollagen) 基因座位,而后用轉基因細胞進行核移植,生產出世界首例基因打靶綿羊,其乳中AAT 蛋白含

13、量達到了650 mg/ L ,遠高顯微注射法18 mg/ L 的水平。研 究 實 例1997 年底,英國Roslin 研究所和PP研 究 實 例2004 年，臺灣培育帶有治療血友病的“第八凝血因子”的體細胞克隆羊。2005 年，這只克隆羊產下一只同樣帶有第八凝血因子的公羊。研 究 實 例2004 年，臺灣培育帶有治療血友病的“第八凝（5） 保 護 瀕 危 物 種核移植重構胚細胞核去核卵母細胞（5） 保 護 瀕 危 物 種核移植細胞核去核卵克隆技術研究未來預測2007 年，生產出的牛羊在奶中分泌貴重藥品 - 乳腺反應器投入生產。動物乳房開始替代部分傳統的制藥工廠。建分廠只須進行克隆。 2008

14、年，克隆應用于器官移植。 2009 年，小鼠實現全程體外培養 - 人造子宮在日本做成。 2010 年，受體卵母細胞實現人為制造。適合常見動物克隆的卵母細胞實現商品化， 2022 年，無卵克隆（又稱植物式克隆），克隆動物像植物般地從單個體細胞生長出來。 2037 年，實現核重建。克隆動物實現數字化批量生產。克隆技術研究未來預測2007 年，生產出的牛羊在奶中分泌貴重克隆技術研究未來預測2055 年，生物技術使得人的生育與性愛分離。生育由變成社會產業，完全實行機械化生產，作為社會的后備力量。 2061 年，機器人智能化。人類分為傳統人、克隆人和機器人三大群體。傳統人感到地位在劇烈下降。 2078

15、年，機器人當選某發達國家總統。 2098 年，發現外星人。 2099 年，時間概念模糊化。 2100 年，傳統人舉行全球游行，抗議機器人和克隆人對傳統人的歧視。克隆技術研究未來預測2055 年，生物技術使得人的生育與性愛12.6.2 克隆人12.6.2 克隆人(1) 克隆人制備過程將普通的男性細胞或者是主體細胞和一枚女性卵子結合起來，儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除。通過細胞分裂形成的胚胎應只帶有這名男性的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，獲得男性克隆后代。當然，如果一對夫婦愿意的話，也可以克隆女性。(1) 克隆人制備過程將普通的男性細胞或者是主體細胞和一枚克隆人技術過程克隆人技

16、術過程克隆的人類胚胎克隆的人類胚胎但他們強調：不會制造用于生育目的胚胎，他們的研究是為了幫助病人。威斯特將這一成果稱為走向醫學新時代的“蹣跚第一步”，是治療性克隆研究中的重大突破，將幫助研究人員找到治療帕金森綜合征、糖尿病和早老性癡呆等疾病的方法。但他們強調：不會制造用于生育目的胚胎，他們的研究是為了幫助病 (2) 有關克隆動物與人存在的問題 (2) 有關克隆動物與人存在的問題 技術尚不成熟得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過程中，科學家共克隆出277個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產的只有多莉一個。目前，多莉羊的制備還不能重復，更

17、不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動物或其它不同組織器官的細胞。 技術尚不成熟得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。277次乳腺細胞核移植實驗； 遺傳、疾病問題 克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。 克隆動物沒有遺傳物質的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發生。 遺傳、疾病問題 克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾多利于1996年7月5日出生， 1998年4月與威爾士山羊戴維產下邦尼，證明了克隆動物也能生育。2003.2.14日蘇格蘭向外

18、界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊” 。多莉的生命歷程多利于1996年7月5日出生， 1998年4月與威爾士山羊戴克隆有缺陷 克隆鼠突然“發福”克隆有缺陷 克隆鼠突然“發福” 社會、倫理學問題一個例子人+動物中山醫科大學陳系古教授等于2001年1月以來，先后使用“核移植”技術，將人類皮膚細胞核移植到家兔卵母細胞中，經過2000多次實驗，成功克隆出100多個人類胚胎，其中部分發育到“桑葚胚”階段。這是國際上首次用該技術克隆出人類胚胎。但有些學者就對在家兔卵母細胞中克隆出人類胚胎的提出質疑，認為這是違背人類倫理的“科學”實驗。 社會、倫

19、理學問題一個例子人+動物中山醫科大學陳系古(4) 聽一聽：關于克隆人的爭論(4) 聽一聽：關于克隆人的爭論贊同的迄今為止，公開宣稱要進行克隆人的只有3家：一個是意大利婦科專家安蒂諾利。一個就是在美國開公司的法國女科學家布利吉特布瓦瑟利耶。一個是美國專家扎沃斯。贊同的迄今為止，公開宣稱要進行克隆人的只有3家：意大利醫生安蒂諾里克隆人的帶頭人意大利醫生安蒂諾里克隆人的帶頭人冒死也要克隆人的科學家布瓦瑟利耶 冒死也要克隆人的科學家布瓦瑟利耶 反對的反對的“多利羊”之父反對克隆人被譽為“多利羊”之父的英國科學家威爾穆特1月4日稱，“多利羊”感染了早期關節炎，哺育動物的克隆安全問題再度受到質疑。威爾穆特呼吁，反對任何克隆人的計劃。“我認為，已經有足夠的證據表明，克隆人的行動是完全不負責任的。”他說，克隆技術目前還存在很多不確定因素，他們在對動物進行實驗時經常遇到大量畸形或異常情況，因此克隆技術目前不適合用于人類。“多利羊”之父反對克隆人被譽為“多利羊”之父的英國科學家威爾任何克隆動物都有基因上的缺陷。克隆羊和克隆牛都有體形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、豬都存在發育不良、免疫系統 缺陷和心肺功能不健全的問題。“多利羊”之父反對克隆人任何克隆動物都有基因上的缺陷。“多利