1、景天愈傷組織玻璃化發(fā)超低溫冷凍保存繼代培養(yǎng)基為D3培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)。Ph值5.8，溫度25C預(yù)培養(yǎng)：將培養(yǎng)了 15 d的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含6%(們二甲亞颯(DMSO)的繼代培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7 d,以 同一批次未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織為對照組.肉蓯蓉愈傷組織的超低溫保藏方在含高濃度甘露醇(0.75mol/L)、山梨醇(0.75mol/L)的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d-銀杏愈傷組織超低溫保存的研究:將3周齡的愈傷組織轉(zhuǎn)入含5%DMSO的MS培養(yǎng)基，置于4 一 6C低溫鍛煉12 天。半楓荷愈傷組織超低溫保存研究初報將愈傷組織轉(zhuǎn)至含5% DMSO的培養(yǎng)基上，置于4-6C低溫下鍛煉12天。杜仲愈傷組織超低溫保存的研

2、究將愈傷組織轉(zhuǎn)至含5%二甲亞颯(DM SO)和5%蔗糖的MS+6-BA 1mg/L+NAA 0. 5 mg/L+2,4D 0.25 mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)(0,1,2.9,10d),比較不同預(yù)培養(yǎng)時間對超低溫保存后愈 傷組織存活率的影響.歐柑愈傷組織的玻璃化法超低溫保存研究將處于對數(shù)生長期的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入含有4%, 6%, 8%蔗糖的培養(yǎng)基(其余成分同誘導(dǎo) 培養(yǎng)基)中預(yù)培養(yǎng)3d, 5d, 7d，以3%蔗糖濃度不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)為對照。仙客來愈傷組織的超低溫保存冰凍保護(hù)劑的預(yù)處理：2-3 mg愈傷組織放人管內(nèi)，置冰浴(0C)中，加人預(yù)冷到0C的冷凍保護(hù)劑，使之淹沒愈傷組 織，0C靜止預(yù)處理

3、30 一 45 min.香雪蘭愈傷組織超低溫保存的研究選直徑約0.5cm的愈傷組織，放進(jìn)4 ml聚乙烯冷凍管，加入0。預(yù)冷的冷凍保護(hù)劑，淹沒 愈傷組織，旋緊管塞，在0C冰浴中靜置30min杜仲愈傷組織超低溫保存的研究設(shè)計冰凍保護(hù)劑：除二甲基亞颯(DMSO)外，各類冰凍保護(hù)劑先溶于1/2MS培養(yǎng)基大量元素培養(yǎng)液中，于105 C 高溫高壓滅菌10 min,無菌條件下加入二甲亞颯銀杏愈傷組織超低溫保存的研究采用均勻設(shè)計法，考察DMSO(二甲基亞颯)，Gly(甘油)、PEG (聚乙二醇),Glu(葡萄糖)、Suc(蔗糖)、LH(水解酪蛋白)搭配組合成的12種復(fù)合冷凍保護(hù)劑的冷凍保護(hù)效果。香雪蘭愈傷組織

4、超低溫保存的研究冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞生活力的影響選用U12 (1212)均勻設(shè)計表，考察冷凍保護(hù)劑的不同種類、水平和組合對愈傷組織超低溫 保存后細(xì)胞生活力的影響，其因子水平見表3,實驗安排及結(jié)果見表4衰3因子水平衰因2345678L(J1112DMS5 % )0Q2.52.55y7.57.5IQ1012.512.5Cily( % )(Q2.52.5557.57.5101(112.512.51頃；(,% )(002.52.52.55557.57.57.5Glu( % )0002,52.52.55557.57.57,5Suc( %)002.52 5557.57.5101(112.512.5LH(%)0

5、(J0.50.5IL1.51.5222.52.5妻4 Ul12勺奕驗安排及皓果安駙DMSO、 (%)Gly (%)PEG(%)%)stc(%)4(g/U1002.55102.Q202.57.5051.532.552.57.500.542.57.57.52.5W055102.5Q52.56512.57.55Q1,577.5002.512.51.087.52.557.57.5【9105052.52.51()It)7.55012.52.0n12.5LO07.57.51.01212.512.552.52.50.5半楓荷愈傷組織超低溫保存研究初報冰凍保護(hù)劑加入與降溫處理：選擇首次繼代培養(yǎng)21d的銀杏愈傷

6、組織(200 mg)放入有刻度的10 mL試管中，分兩組實驗。一組在室溫下加入冰凍保護(hù)劑，另一組在冰浴上加入預(yù)冷至0C左右的冰凍保護(hù)劑，處理時 間均為1h 銀杏愈傷組織超低溫保存的研究較理想的冰凍方式，即以1C/min或0.5C/min 2種速度降溫，在一 15C停留10 min, 35C 停留30 min后，再投入液氮中保存。銀杏愈傷組織超低溫保存的研究:采用單因子比較法，考察快速冷凍法、兩步冷凍法及兩步冷凍法在一32停留不同時間(0.5,1,1.5,2,4,8hr)的冷凍保護(hù)效果。香雪蘭愈傷組織超低溫保存的研究愈傷組織經(jīng)預(yù)處理后，以0. 5C/min的速度，從0C降至一 32 C，停留lh

7、r后投入液氮。-杜仲愈傷組織超低溫保存的研究快凍:將預(yù)處理后的材料從0C直接投人液氮（一 196C）中.逐級冷凍:將預(yù)處理后的材料，依次通過一 10C, 24C, 30C, 50C，每級停 留4 min,再投人液氮. 香雪蘭愈傷組織超低溫保存的研究將愈傷組織塊200 mg放入冷凍管，加入保護(hù)劑，在不同的溫度（5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 C ） 下處理不同的時間（5, 10, 15, 20, 25 min）.然后在0C預(yù)冷30 min接著投入液氮中凍存4 h.肉蓯蓉愈傷組織的超低溫保藏方法化凍與洗滌：愈傷組織在液氮中保存10天后，采用30C溫水浴快速化凍。待冷凍管中的冰融

8、化后，立即 加入MS培養(yǎng)液，輕輕振搖，停止10min，傾出溶液。如此反復(fù)洗滌3人-4次。洗滌后的愈 傷組織即可用于再培養(yǎng)或測定細(xì)胞生活力。杜仲愈傷組織超低溫保存的研究材料在液氮中保存24 h后，取出冷凍管進(jìn)行迅速化凍，比較4- 6C低溫、室溫、自來水水 流（18. 5 士 2）C沖洗及30,40,50C水浴化凍的效果.用含1. 2 mol/ L蔗糖的MS+6-BA 1 mg/ L +NAA 0.5 mg/L+2, 4-D 0. 25 mg/ L基本培養(yǎng)液，在室溫下洗滌3次，每次10 min.歐柑愈傷組織的玻璃化法超低溫保存研究冷凍后的愈傷組織在不同溫度（10, 20, 30, 40, 50,6

9、0C）的水浴中解凍，然后用含不同蔗糖（0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0, 1.2 mol/L）的 B5培養(yǎng)基在室溫（25C ）條件下對愈傷組織進(jìn)行3次洗滌，每次 10 min.肉蓯蓉愈傷組織的超低溫保藏方法細(xì)胞生活力測定細(xì)胞存活率=未處理細(xì)胞的TTC值/未處理細(xì)胞TTC值*100%采用TTC法（氯化三苯四氮唑還原法）測定細(xì)胞生活力。稱取化凍洗滌后的愈傷組織200mg，放入具刻度的10ml試管中，加0.1%TTC溶液5ml，在 黑暗、23 士 2C的恒溫箱中靜止培養(yǎng)22 - 26hr,再吸去TTC溶液，加蒸餾水洗滌2-3次，然 后加入5ml 95%乙醇，將試管放入60C水浴中加熱20

10、-30min，提取氯化三苯四氮唑被脫氫 酶還原后生成的紅色甲橫在2500轉(zhuǎn)/分條件下離心5min，取上清液，用721型分光光度計 在490nm波長處測試吸收值。用這種吸收值（TTC值）表示各處理的愈傷組織在超低溫保存 后的細(xì)胞生活力。半楓荷愈傷組織超低溫保存研究初報TTC法（氯化三苯四氮哇還原法）測試按TOW ill和Mazur方法稱取洗滌后的愈傷組織200mg， 放人具刻度的10ml試管中，加人5 ml TTC試劑，在黑暗22-25C下靜止培養(yǎng)18-20小時， 吸去TTC溶液，用蒸餾水洗滌2-3次，然后加人5m1 95%乙醇，將試管放人60C水浴中加 熱20-30分鐘，提取氯化三苯四氮唑被脫

11、氫酶還原后生成的紅色甲措 最后用Specord型分 光光度計在485 nm波長處測試提取液的吸收值。用這種吸收值表示各處理的愈傷組織在超 低溫保存后的細(xì)胞存活力。甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究采用TTC法（氯化三苯基四氮唑還原法）測定細(xì)胞生活力。稱取洗滌后的愈傷組織200g，放 入試管中，加入0. 1 % TTC溶液（用0. 2mol/L的磷酸緩沖液配制成pH=7）5m1,置于22C恒 溫箱中染色26hr。取出吸去TTC液，用重蒸餾水漂洗2-3次后，加入5ml 95%酒精，置于 60C水浴中加熱30min，提取氯化三苯基四氮唑被脫氫酶還原后生成的紅色甲楷取上清液 在721型分光光度計4

12、90nm波長處測定吸收值.用這種吸收值（TTC值）表示各處理愈傷組織 在超低溫保存后細(xì)胞的生活力.-杜仲愈傷組織超低溫保存的研究愈傷組織生長周齡對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響采用單因子比較法，考察冷凍保存后細(xì)胞生活力半楓荷愈傷組織超低溫保存研究初報什么是玻璃化法超低溫保存溶液經(jīng)晶核形成和晶核生長過程而固化。溶液在降溫時，如果沒有非均一晶核或晶核 生長缺乏足夠的時間，就首先成為過冷的溶液，它是低于冰點而不結(jié)冰的液態(tài)。繼續(xù)降 溫，均一晶核開始形成，這時候的溫度叫均一晶核形成溫度，也叫過冷點(Th)。如果降 溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶;降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或 均一晶核生長缺乏足夠的時間，溶液就進(jìn)人無定形的玻璃化狀態(tài).它是一種透明的“固 態(tài)”，此時的溫度叫玻璃化形成溫度(Tg).此刻，既沒有溶液效應(yīng)對細(xì)胞的損傷，也沒 有冰晶對細(xì)胞的損傷。玻璃化法-園藝作物莖尖和分生組織超低溫 保存的新途徑-文獻(xiàn)綜述玻璃化法凍存園藝作物莖尖和分生組織的基本程序保護(hù)劑的毒性及滲透損傷的程度取決于保護(hù)劑的濃度和保護(hù)劑處理的時間和溫 度.-Rail, W. F. and Fahy G M.，1985. Nature. 313: 573-575因此，玻璃化超低溫保存