1、用Midi MACS要領從白血病患者分選CD34/CD123細胞王光平，曹星玉，信紅亞，李群，齊振華,陳方平【摘要】本研究的目的是應用idiAS要領從急性髓系白血病AL患者骨髓細胞分選D34+/D123+細胞。起首，用淋巴細胞分散液從AL患者骨髓細胞分散單個核細胞BN，然后再通過idiAS要領相繼分選出D34細胞，以及從D34+細胞中分選出D123細胞并通過流式細胞術闡發分選后細胞的富集度和接納率。效果表現：顛末第一次分選后，D34+細胞的富集度高達98.73%，均勻為95.6%，其接納率最高可到達84.6%，均勻為51%；第二次分選后，D34+/D123+細胞的富集度高達99.23%，均勻約

2、為83%；相對付分選前BN而言，D34+/D123+細胞的接納率為34%，但相對付第一次分選后的D34+細胞而言，其接納率為56%。結論：idiAS要領可用于AL患者骨髓D34+/D123+細胞的分選，分選后細胞的富集度和接納率與文獻報道的通過FAS要領所得到的效果相雷同。【關鍵詞】D34+/D123+細胞；分選要領；idiAS；白血病D34+/D123+ellSrtingfrthePatientsithLeukeiabyidiASethdAbstratTheaifthisstudyastsrttheD34+/D123+ellsfrthebnearrellsfpatientsithauteye

3、lidleukeia(AL)byidiASethd.Firstly,thebnearrnnulearells(BN)ereislatedfrthepatientsithALithFillPaque,D34+ellserethenislatedbyidiASethdflledbytheislatinfD34+/D123+ellsfrthefratinfD34+ells.TheenrihentandreveryfD34+andD34+/D123+ellsereassayedbyFAStehnique.TheresultsshedthattheenrihentfD34+ellsasupt98.73%

4、,itsaverageenrihentas95.6%,andthereveryfD34+as84.6%，itsaveragereveryas51%afterthefirstrundsrting,bythesendrundsrting,theenrihentfD34+/D123+ellsasupt99.23%,itsaverageenrihentas83%.ithregardtBNsbefresrting,thereveryfD34+/D123+as34%.But,ntheD34+ellsbtainedbythefirstrundsrting，itsreveryas56%.Innlusin,th

5、eseresultsnfiredthattheethdfidiASsrtinganbeappliedtsrtD34+/D123+ellsfrthebnearrellsfALpatients,hihgiverisetthesiilarenrihentandreveryfthesrtedellsiththatfliteraturereprtedbytheethdfFAS.KeyrdsD34+/D123+ell；srtingethd；idiAS;leukeia白血病，尤其是急性髓系白血病AL，是劈頭于少量的干/祖細胞疾玻這些干/祖細胞是一些產生了突變的造血干/祖細胞，即白血病干/祖細胞LSP1，2。

6、除了具有正常造血干細胞HS的自我更新和某些細胞表型如D34+、D38-、D71-以及HLA-DR-等特性外，LSP還具有本身特有的表型，即D90-、D117-、D123+3-5。因此，根據這些特異性的表型，可對LSP舉行分散和純化。在分散正常造血干/祖細胞HSP中，AS分選要領得到了普及的應用。但是，接納該要領分選LSP的報道卻很少。為此，本研究應用idiAS分選要領對AL患者的D34+/D123+雙陽性細胞舉行了分眩質料和要領單個核細胞的分散無菌抽取AL患者2例2a，1例13-6l骨髓，放于加有肝素的15l試管內，用等體積無鈣離子的PBS緩沖液Gib產物洗滌和稀釋后，逐步加到含有淋巴細胞分散

7、液購于北京鼎國公司的試管內，于室溫350g離心20分鐘。離心后，警覺撤除上清液并汲取白細胞層于另一新試管內，起首用5l無鈣離子PBS+2l/LEDTA緩沖液以下簡稱為緩沖液1洗滌細胞，于130g離心5分鐘。然后，用5l緩沖液1重懸細胞并于90g離心2次，每次5分鐘。離心后，再用2l的緩沖液1重懸細胞并計數細胞。經60g離心5分鐘后，按每108個細胞用300l的比例參加無鈣離子的PBS+2l/LEDTA+0.5%FS緩沖液以下簡稱為緩沖液2重懸細胞。D34+細胞的分選起首用D34多分選試劑盒iltenyiBite公司產物分選D34+細胞，亦即取已混勻好的關閉試劑100l參加到300l的上述細胞懸

8、液中,混勻后置室溫5分鐘。然后，每108個細胞參加100l的D34磁珠小于108個細胞，仍參加100l的D34磁珠，輕輕混勻后，于4作用30分鐘。用5l緩沖液2重懸細胞，于90g離心25分鐘后，再用5l緩沖液2重懸細胞。將idi分選柱子iltenyiBite公司產物安裝在分選器上，過柱分選之前，先用3l緩沖液2過柱以潤濕柱子。然后，將上述已標識表記標幟好的細胞懸液加到柱子上并經45l緩沖液2過柱洗滌。洗滌后，將分選柱子從分選器上撤離下來并置于另一新的15l試管上，用5l緩沖液2通過加壓的方法洗脫陽性細胞，離心、計數細胞后留獲得當數目的細胞用于流式細胞術闡發。D34+/D123+雙陽性細胞的分選

9、為分選D34+/D123+細胞，起首需撤除細胞上已結合的磁珠。其要領是，每毫升上述細胞懸液參加20l的磁珠撤除試劑，于4作用30分鐘。待反響竣事后，再用33l緩沖液2，按上述要領過柱洗滌。差異的是，此時應網絡通過柱子的細胞。將細胞懸液離心后，每107個細胞用50l緩沖液2重懸細胞小于107個細胞仍用50l的緩沖液以及每107個細胞參加30l的停頓液。然后，在上述細胞懸液中參加80l的緩沖液2，混勻后再參加20l的抗-D123-PE抗體iltenyiBite公司產物于上述細胞懸液中并混勻，于4作用30分鐘。用22l的緩沖液2洗滌細胞，200g離心10分鐘，并按每107個細胞參加80l的比例參加緩

10、沖液2，重懸細胞后再每107個細胞參加20l的抗PE-磁珠iltenyiBite公司產物，于4作用30分鐘。用緩沖液2洗滌細胞2次，90g離心5分鐘。末了，每108個細胞用500l緩沖液2重懸細胞，用于再次分選，過柱分選要領同前。過柱后，計數細胞并留獲得當數目的細胞用于流式細胞術闡發。流式細胞術闡發別離取2105個分選前后的細胞放于一試管內，用PBS緩沖液洗滌2次。經350g離心10分鐘后，撤除上清液并將細胞重懸于500l的PBS緩沖液中。混勻后，取250l的細胞懸液于另一試管內，并將各管別離標識表記標幟為陰性和陽性。在陽性管內參加15l的D34-FIT抗體Pharingen公司產物，而在陰性管內別離參加15l的鼠IgG1-FIT和或鼠IgG1-PE即在D34-N試管內參加鼠IgG1-FIT抗體，而在D34-N/D123-N試管內參加鼠IgG1-FIT和鼠IgG1-PE抗體標識表記標幟細胞作為陰性比較。室溫避光作用30分鐘后，參加1l的PBS緩沖液，于350g離心10分鐘，撤除上清液并參加約500l的PBS緩沖液重懸細胞，上機闡發。由于在D34+/D123+雙陽性細胞分選的歷程中，細胞已用抗-D123-PE抗體舉行了標識表記標幟，因此在舉行流式細胞術闡發時不需再別的參加抗-D123-PE抗體。效果用抗D34磁珠第一次分選D34+細胞后，D34+細胞的富集度高達9