1、無菌檢查法驗證張榮玉一、概述：1.1 定義：系用于檢查藥典要求的無菌的藥品、醫療器具、原料、輔料及其它品種是否無菌的一種方法。2.1驗證的必要性和意義：確認所采用的方法檢查供試品無菌的適合性。保證檢查結果的準確性、可靠性、準確性和重現性；檢查方法的完整性。與同藥品無菌檢查接軌。通過對不同品種、批號的無菌檢查比較；對產品生產全過程進行質量監控。二、存在問題:2.1 專業人才少,缺乏相應的培訓和管理。2.2 工作量大,導致操作不規范。2.3 檢驗方法缺陷，如直接種法可操作性差，引入污染的風險較大。2.4 試驗條件的影響環境影響培養基、稀釋劑、沖洗液。所用品、器具清潔滅菌。三、無菌檢查的試驗要求:3

2、.1 環境：10000級局部以下100級，布局符合無菌 操作要求；或隔離系統（生物安全柜）。3.2 人員：必須具備微生物專業知識，并經培訓。3.3 設備、器件、材料：經處理必須符合無菌要求，培養箱的溫度指示裝置要校驗。3.4 培養基：3.4.1 按藥典規定處方配制，采用經驗證合格的滅菌程序滅菌。3.4.2 保存：2-25 避光保存；期限：非密閉容器3周，密閉容器1年。3.4.3 培養基適用性、無菌性、靈敏度檢查。3.4.4 靈敏度檢查：3.4.4.1檢查用菌株傳代不得超過5代。3.4.4.2常用菌株：金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26003)銅像假單胞菌CMCC（B）10104枯草芽胞桿菌CM

3、CC（B）63501生孢梭菌CMCC（B）64941白色念珠菌CMCC（F）98001黑曲霉CMCC（F）980033.4.4.3菌液配制、保存、接種培養按藥典要求。3.4.4.4結果判斷：空白對照應無細菌增長，加菌液的培養基管均生長良好，培養基靈敏度符合要求。3.5 稀釋液、沖洗液：3.5.1 按藥典規定配制后采用經驗證的滅菌程序滅菌。3.5.2常用稀釋液、沖洗液：0.1%蛋白胨水液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液無菌0.1%氯化鈉液中性磷酸鹽緩沖液含0.1%聚山梨酯（吐溫-80 ）的0.1%蛋白胨水溶液3.5.3 依據供試品的特性選擇稀釋液、沖洗液。四、無菌檢查法驗證:4.1 原理:驗證的所

4、有環境、培養基、菌株、稀釋液、沖洗液均與日常檢查方法相一致、并符合相關規定。4.2 驗證分類：前驗證：建立無菌檢查方法時。再驗證：修訂檢查方法時。定期驗證：供試品組合或原檢查條件改變。4.3 驗證方案制定原則：供試品的抑菌性，敏感菌種選擇;適當的方法消除或降低抑菌性。樣品的預處理方式能有效抵消（或中和）產品的抑菌性。樣品的預處理方式、檢驗過程、培養條件均不影響樣品中微生物的生長。驗證記錄真實完整地記錄所做試驗。4.4 驗證重點環節分布：樣品需前處理不需前處理驗證前處理方法對污染菌生長，檢出影響有抑菌作用去除抑菌作用通過驗證實驗判無抑菌作用驗證抑菌活性去除方法的有效性及對污染菌檢出物影響檢驗4.

5、5 驗證方法：4.5.1 制備驗證試驗菌液，按藥典方法配制菌液。4.5.2 選擇配制適合的培養基、稀釋液、沖洗液。4.5.3 供試品的處理：驗證所用的溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等的有效性，使用量及微生物生長無影響。驗證加熱溫度、離心速度和時間對微生物生長或分布無影響。不需前處理的供試品免做。4.5.4 無抑菌性樣品的驗證方法：依據產品溶解性和微生物限度選擇合適的中性稀釋劑溶解和稀釋，用直接接種法驗證，常用中性稀釋液或淋洗液。4.5.5 具有抑菌性樣品的驗證方法：確定抑菌作用（抑細菌、真菌試驗驗證），選擇敏感菌株對供試品抑菌活性去除效果檢驗（陽性菌回收試驗）。消除樣品抑菌性的方法驗證： 化學

6、鈍化中和法（化學試劑中合法）：利用化學（生物）專屬性滅活，常用鈍化劑有：對氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜過濾法和直接接種法也可用。對化學中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如 -內轉氨酶。稀釋中和法：利用降低供試品的相對濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進行。薄膜過濾法：利用體積差異分離，通過薄膜過濾，微生物被截于濾膜，培養薄膜觀察有無微生物生長。各方法組合運用，效果更好。 驗證方法:a.驗證分組： A組:樣品組,適當方法中和樣品,加入少量驗證微生物(接種量少于100cfu)。B組:對照組,0.1%蛋白胨或PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液,加少量微生物(接種量少于100cfu).C組：陽性

7、對照組，不經中和處理，將實驗菌株直接接種于培養基中(接種量少于100cfu)。b.結果分析:A組與B組微生物生長數量相似，表明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性，如果B組與C組的微生物數量相似，表明樣品預處理用中和劑的毒性、檢測程序和培養條件等均不影響微生物生長。樣品如無抑菌性，省去B組試驗，A組與C組直接比較。A組微生物生長數量不及C組微生物生長數量，表明試驗用器具材料或培養條件等方面存在對微生物生長不利因素。c.為考查驗證方法的穩定性和重現性，驗證至少需3個不同批次的同類樣品，分別進行3次驗證實驗。五、供試品無菌檢查驗證:5.1 按藥典要求確定檢驗數量、檢驗量、設立陽性對照和陰性對照。

8、5.2供試品無菌檢查方法和檢驗條件與驗證方法相同。5.3直接接種法驗證試驗：5.3.1 供試品有抑菌時，按培養基靈敏度試驗的菌種，向該種無菌檢查培養基內加入該微生物，每種培養基接2瓶，每瓶接種量控制10-100cfu之間。5.3.2 參照藥典規定確定培養基用量，按無菌檢查要求向上述其中一瓶加入規定量供試品，另一瓶為陽性對照。5.3.3 將種好的容器按藥典規定溫度培養14 days。5.3.4 驗證結果評價： 供試品與陽性對照相比、供試品容器內微生物生長不明顯，說明有抑菌性。可使用中和劑如比溫-80。 -內酰胺酶等消除抑菌效果。中和劑不能消除抑菌作用，適當增加培養基體積稀釋。5.4 薄膜過濾法驗

9、證試驗：5.4.1 薄膜過濾法驗證試驗供試品有抑菌特性時，在同型號的每個過濾器加規定定量的供試品（容器數及每容器的過濾體積）。淋洗至少3次，淋洗液為100ml/次，最后一次淋洗液中，接種驗證用菌株（10-100cfu）；取另一濾器不過濾供試品，重復上述淋洗操作，作為陽性對照。分別將靈敏度實驗的菌種及相應培養基逐一試驗。5.4.2 供試品和陽性對照接種后、培養基容器按藥典菌株要求溫度下培養，時間不超過14days。5.4.3 使用新的濾膜過濾器（不同廠家或批號、型號）重新進行樣品試驗組、蛋白胨對照組和陽性對照組的驗證確認。5.4.4 驗證結果評價：供試品培養基容器內可見微生物生長明顯（混濁），與

10、陽性對照組比較結果相似，則在無菌檢查試驗中必須過濾與驗證試驗相等量的供試品、淋洗液。淋洗相同次數及使用相同量的培養基。供試品培養基容器內與陽性對照結果相比微生物生長不明顯，應增加淋洗次數、重復上述試驗。六、驗證合格標準:6.1平皿菌落計:6.1.1 通常用于藥品防腐劑防腐效力測試和微生物限度檢查中。計數每毫升（或克）樣品的微生物含量。6.1.2 每種試驗菌每組至少重復3次（3個不同批次的樣品）。6.1.3 合格標準：A組（樣品試驗組）驗證微生物平均生長數量不低于C組（陽性對照組）驗證微生物平均生長數量的70%，檢驗方法通過驗證。6.2 直接接種法：6.2.1 培養基能中和抗菌劑的抑菌性，并適合

11、廣譜微生物的生長，包括樣品種潛在微生物生長。6.2.2 每種試驗菌種每組實驗至少獨立重復3次。如需要改變產品和培養基比率達到中和效果。6.2.3 合格標準：3批（不同批次的樣品）在14days內所有樣品試驗組中培養基都顯示大量的微生物生長，則相應的試驗方法通過驗證。6.3 薄膜過濾法：6.3.1 適用于無菌檢查和生物限度堅查，樣品必須能被過濾。需溶解的樣品應驗證該樣品的溶解方式及整個試驗過程，試驗用具和材料及培養條件等不會影響樣品中固有的微生物的生長。6.3.2 樣品試驗組、樣品溶液通過薄膜，用適量淋洗液淋洗3次，在最后一次淋洗液中接入少量（10-100財富）驗證菌。淋洗后，將濾膜轉移到固體培

12、養基（或液體培養基中）培養。樣品抑菌性強、則應進行中和處理，再驗證中和效果。6.3.3 蛋白胨對照組：不加產品的稀釋液，其他操作及實驗條件與樣品試驗組相同。驗證中和用鈍化劑（針對需預處理的樣品）、過濾器和濾膜材質是否會對微生物產生影響）。6.3.4 陽性對照組：將與上述兩組等量同種驗證菌液（10-100cfu）直接種到固體培養基表面（或液體培養基中）。比較蛋白胨對照組和陽性對照組微生物的情況，估算濾器和濾膜造成微生物的損失量。6.3.5 3次試驗（3個不同批次的樣品）結果評價：上述3組試驗結果間差異均在70%以上（固體培養基）或培養14days內所有試驗組的液體培養基微生物均有生長，則認為驗證

13、微生物的回收率基本相同，相應的微生物驗證方法同過驗證。七、驗證試驗結果的評價與報告:7.1 分析評價主要包括有：7.1.1 對每個驗證試驗的菌株、每次驗證試驗的數據及其有效性和合理性評價。7.1.2 驗證試驗數據所表明的檢品預處理方式、檢驗用器具、材料、培養條件等的合理性是否符合規定要求，它們與藥品檢驗的規程要求是否符合。7.1.3 驗證試驗數據最后要說明該藥品的微生物檢測方法是否準確、有效、可靠與可行，是否有較好的重現性。最后得出結論。7.2 驗證試驗報告內容包括有：7.2.1 驗證試驗藥品的名稱，待驗證檢驗方法的有效登記號。7.2.2 驗證試驗用菌株名稱、菌號、試驗室控制號、轉種代數。7.

14、2.3 驗證菌株的制備和接種記錄。7.2.4驗證供試品的預處理方法、檢驗用具和材料、檢測步驟以及培養條件等。7.2.5 驗證試驗結果的評價及結論。7.2.6 驗證條件：包括驗證試驗的原始記錄，包括驗證菌株的制備和接種量復核、驗證試驗結果等。無菌驗證范例（注射劑無菌檢查方法）一、材料：1.1 樣品：品名、規格、批號、生產批號。1.2 培養基稀釋液：硫乙醇酸鹽液體培養基、批號；改良馬丁液體培養液，批號；營養肉湯培養基，批號；營養瓊脂培養基，批號；0.1%蛋白胨滌養，PH7.1 0.2；培養基和稀釋液來源。1.3 驗證試驗用菌種：所用菌代數。金黃色葡萄球菌（26003）；銅綠假單胞菌（10104），

15、枯草芽孢桿菌（63501）;生孢梭菌（64941）；白色念珠菌（98001）；黑曲霉菌（98003），上述菌種的來源及傳代數。1.4 儀器和濾器：HTY-2001A集菌儀；全封閉無菌試驗過濾培養器，批號及生產廠商。二、驗證方法：2.1 菌液制備：取經34培養18-24h的金葡萄、銅綠假單胞菌，枯草孢芽菌的新鮮肉湯培養物1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10-5 、10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經34培養18-24h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養物1ml。加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml， 10倍稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經24培養的白

16、色念珠菌改良馬丁液體培養物1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml， 10倍稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經24培養一周的黑曲霉料面培養物，加入無菌0.9%氯化鈉溶液10ml，洗下孢子；吸出孢子懸液，過濾除去菌籽，收集菌液至另一無菌試管，取菌液0.1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9.9ml，稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。2.2 菌液計數：每種菌液接種工作皿、取平均值。計數結果列表（略） 。2.3 方法驗證及結果：直接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養基2ml/支后，再按要求加入相應陽性菌液（30-100cfu/ml)。置規定

17、溫度培養3-5days，逐日觀察、記錄微生物生長情況。列表（略）。薄膜過濾法：取樣品1支，將樣品過濾于封閉式濾器（3連筒/套）。用0.1%蛋白胨氯化鈉溶液500ml沖洗后，再分別加入金黃色葡萄球菌，枯草桿菌50-100cfu/筒，同時做平均稀釋液對照組。將稀釋液對照濾筒和陽性菌的驗證過濾筒置于規定溫度下培養3-5days。逐日觀察、記錄微生物生長情況，列表（略）。2.4 陽性對照：稀釋劑+培養液，不加對照菌液，其它操作同前供試品試驗，并計數試驗菌液的計數。三、結論： 選擇無菌檢查方法，確定陽性對照菌和0.1%蛋白胨水溶液的沖洗量。1.認真執行安全技術措施及安全操作規程，負責對施工班組人員及分包方人員進行有針對性的安全技術交底，履行簽字手續，并對規程、措施及交底執行情況經常檢查，隨時糾正違章作業；2.負責檢查督促每項工作的開展和接口的落實，有權拒絕不符合安全操作的施工任務，除及時制止外，有責任向項目經理匯報；3.參與對分包方評價，制訂與分包的安全、治安、消防和環境衛生等協議書，并對分包合同、協議的履行實施全過程控制，并做好記錄；4.對安全部門或上級提出的事故隱患整改要求，按照糾正和預防措施要求，落實人員實施整改；5.負責對重點、危險部位和過程的監控，落實監控人員，組織對監控人員素質和技能的