1、制備色譜技術(shù)及方法建立 內(nèi) 容1 、概述2、常用制備色譜技術(shù)3、其它制備色譜技術(shù)4、展望 制備LC與 分析L比較 目的 填料流量流通池 聯(lián)系 制備HPLC樣品中特定成分的高純度獲取，大量、廉價的制備 20以上為佳 10-150ml/min 最大允許流速可為150mL/min在進行制備HPLC之前，常先進行分析HPLC實驗，對分析方法進行優(yōu)化、放大應(yīng)用到制備HPLC中。分析HPLC 定性分析：檢測的靈敏度定量分析：分離度、再現(xiàn)性 3-5 0.001-9.999ml/min最大允許流速僅為5 mL/min，或者10mL/min一、 概 述 線性色譜和非線性色譜 制備分離的目標和策略 制備分離的五要

2、素樣品性質(zhì)： 組成、基體、含量、價值等產(chǎn)品純度： 天然產(chǎn)物、測試樣、生物活性等 (70%) (95%) (活力)制備量：mg, g, kg, t時間和成本：科學(xué)研究 工業(yè)生產(chǎn) 分離的影響因素固定相、 流動相選擇固定相顆粒直徑、上樣量、流動相等適當增加有利于制備分離選擇最佳TLC 、HPLC 分離條件分析型TLC 或HPLC 上進行半制備性分離 放大到制備規(guī)模分析型TLC 或HPLC 上進行產(chǎn)品純度檢驗如不符合要求，重新進行上述實驗制備色譜操作條件優(yōu)化一般步驟二、常用制備色譜技術(shù)1 、制備薄層色譜2、經(jīng)典柱色譜3、低壓、中壓制備色譜4、高壓制備液相色譜5、特殊形式色譜柱6、柱色譜中分離、實驗條件

3、選擇制備薄層色譜 展開槽 處理樣品量 1mg 1g 條狀上樣 薄層制備 活化 點樣 展開 檢測/收集Centrifugal Thin-Layer ChromatographHarrisonHitachi 離 心 薄 層上個世紀60年代Dalcortivo 提出， 又稱旋轉(zhuǎn)薄層 特點： 操作簡便、分離時間短、可重復(fù)使用 經(jīng)典柱色譜類型： 吸附柱色譜： 硅膠、 氧化鋁、聚酰胺等 分配柱色譜：載體（硅膠、硅藻土、纖維粉等）吸附一層液體構(gòu)成 固定相，用另一種不相溶的溶劑洗脫 離子交換柱色譜：交聯(lián)聚苯乙烯離子交換樹脂 凝膠柱色譜： 瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖 親和柱色譜：載體（瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、硅

4、膠等） 表面鍵合配基 干柱色譜：填充劑按干法裝在柱中,欲分離的混合物吸著在干柱的頂端,用溶劑洗 脫,待溶劑達到柱底為止.以熒光定性或以化合物在薄層上的Rf值推定 位置,根據(jù)各個成分的位置進行分割,各段以有機溶劑提取. 優(yōu)點：薄層色譜條件可直接套用到干柱色譜 分離效果比濕裝柱高 樣品帶可切割，避免各成分交叉 溶劑消耗少，操作簡單缺點：裝填技術(shù)要求高 柱樣品容量較小 方法建立： 分離類型選擇 色譜柱選擇 ： 材料 （玻璃、聚乙烯薄膜柱等） 尺寸 （內(nèi)徑：柱長=1：101：20） 填充劑選擇： 粒度（200400目） 用量（1：201：500） 預(yù)處理 洗脫劑選擇： 薄層色譜篩選 上樣方式： 凈試樣

5、法、溶液法、涂覆法 后處理： 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、重結(jié)晶等 低壓及中壓制備色譜提高壓力，增大流速低壓（ 幾個大氣壓）中壓 （幾十個大氣壓） 低壓制備色譜減壓柱色譜加壓柱色譜 雙鏈球 空氣泵 蠕動泵 中壓制備色譜高壓制備色譜 檢測器： 示差折光、 紫外 （分流器）特點： 1 柱長： 2050CM 2 內(nèi)徑：1100CM 3 顆粒小，流速高 特殊形式色譜柱優(yōu)點：樣品處理量大流動相流速高節(jié)省分析時間生物樣品： 蛋白質(zhì)、多肽、核酸 色 譜 餅 大 直 徑 柱 徑向壓縮 軸向壓縮 環(huán)型壓縮用于石油化工、食品工業(yè)、藥物工業(yè)等NovasepWatersd 10cm 軸向壓縮技術(shù) 尺寸：41.6 填料：4000kg重量

6、： 36 000kg 徑 向 柱特點： 外表面大，樣品上樣量多； 增加色譜柱長度，可成線性增大制備量； 樣品保留時間短，可保留活性應(yīng)用： 生物活性樣品制備（離子交換和親和色譜）柱色譜中分離、實驗條件選擇峰接觸法峰重疊法微量組分的分離 難分離物質(zhì)對的分離 正相色譜系統(tǒng)反相色譜系統(tǒng)三、其它制備色譜技術(shù)Simulated Moving Bed Chromatography (SMB)Preparative Gas Chromatography Preparative Electrophoresis HSCCC 原理及應(yīng)用DrIto，1966： 運動螺旋管內(nèi)兩液相對流分配的現(xiàn)象。操作過程： 一根100

7、多米長的螺旋空管，注入互不相溶的兩相溶劑中的一相作為固定相，然后用進樣器進樣；最后用恒流泵不斷注入另一相（流動相），同時啟動主機部分運轉(zhuǎn)。由于行星運動產(chǎn)生的離心力場使得固定相保留在螺旋管內(nèi)，流動相則不斷穿透固定相；這樣兩相溶劑在螺旋管中實現(xiàn)高效的接觸、混合、分配和傳遞。由于樣品中各組分在兩相中的分配比不同，因而能使樣品中各組分得到分離。 北京新技術(shù)研究所張?zhí)煊樱?980年，第一臺逆流色譜儀器 HSCCC 原理示意圖1.聚四氟乙烯管中的固定相不需要載體，因而消除了常規(guī)色譜中由于使用載體而 帶來的吸附現(xiàn)象，特別適用于分離極性物質(zhì)和具有生物活性的物質(zhì) 。2. 由于其與一般色譜的分離方式不同，使其特別

8、適用于制備性分離。 最近的研究結(jié)果表明：一臺普通的高速逆流色譜儀一次進樣可達幾十毫升， 一次可分離近10g的樣品。 應(yīng)用 中草藥及天然產(chǎn)物有效成分的分離純化：目前香豆素， 內(nèi)酯類，黃 酮，類黃酮，生物堿 類，蒽醌，木質(zhì)素，多酚類，苷類，萜類，有機 酸、酸酐及酯類等領(lǐng)域都實現(xiàn)了高純度 的制備分離，純度等達到99 以上 。 大分子生物活性物質(zhì)的分離：蛋白質(zhì)、多糖、多肽等生物大分子的分離 。 發(fā)酵產(chǎn)物純化領(lǐng)域：福建微生物研究所成功的分離純化環(huán)孢菌素，得到純 度98.5%以上的 環(huán)抱菌素A,B,C,D單組分,收率達 8 5 %以上 。 SMB 原理及應(yīng)用不能連續(xù)操作柱材料利用率底溶劑耗量大連續(xù)進樣、連

9、續(xù)出料提高生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本20世紀60年代UOP， 應(yīng)用于石油化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)能力 提高60倍溶劑耗量 減少80倍 移動床色譜示意圖分離材料磨損 大型 模擬移動床色譜示意圖 剛進樣 初步分離 穩(wěn)定狀態(tài)法國Separex (Novasep)公司LicoSep 6-800系統(tǒng) 鞍山科技大學(xué)林炳昌 教授研制的 模擬移動床色譜儀器應(yīng)用 1 石油化工 領(lǐng)域： 對二甲苯與間二甲苯分離；對甲苯酚與間甲苯 酚；蒎烯混合物中分離蒎烯。 2 糖醇分離： 萬噸果糖生產(chǎn)設(shè)備（蔗糖水解產(chǎn)物果糖與葡萄糖分離） 3 手性分離： 氨基酸、布洛芬、troger堿等的分離。 制備氣相色譜技術(shù) 氮 氣 填充柱預(yù)熱 制 備 電 泳

10、 技 術(shù)電泳： 帶電離子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電泳。聚丙烯酰胺凝膠： 是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)和加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，具有良好的分子篩效應(yīng)。它已成為目前生化實驗室最常用的支持介質(zhì)。以它為支持物發(fā)展起來的各種聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，不僅能分離、小量制備生物大分子，而且可以用來研究生物大分子的性質(zhì)如電荷、相對分子質(zhì)量、等電點以及構(gòu)象等。制備凝膠-上樣-電泳-活性染色-脫色-制干膠 Pharmacia公司的SE250小型夾心式垂直板電泳裝置LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2 1 2 3 4心肌乳酸脫氫同工酶(LDH)的電泳分離 四、展望 新的高性能色譜分離材料設(shè)備性能、工藝優(yōu)化理論模型的深入研究低成本、環(huán)保、實用周同惠等。紙色譜和博層色譜。北京