1、第七章 克隆基因的表達外源基因在宿主細胞中表達外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中 表達出蛋白質提取蛋白宿主細胞：原核細胞或真核細胞。克隆基因的表達：原核生物基因表達系統真核生物基因表達系統大腸桿菌表達系統芽孢桿菌表達系統鏈霉菌表達系統酵母表達系統絲狀真菌表達系統昆蟲表達系統哺乳動物細胞表達系統植物生物反響器常見表達系統的類型用原核生物作宿主A dividing E. coli 第一節 外源基因在原核細胞中的表達原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子識別原核細胞的啟動子，催化一切的RNA合成。很多功能上相關的基因前后相連成串，由一個共同的控制區進展轉錄的控制。一、原核生物基因表達的

2、特點2. 以支配子為單位1. 只需一種RNA聚合酶3. 轉錄和翻譯偶聯、延續進展。4. 不含內含子，缺乏轉錄后的加工系統5. 調控主要在轉錄程度上位于mRNA的起始密碼AUG的上游510個堿基處，同核糖體16S rRNA3末端序列互補，協助從起始AUG處開場翻譯 。6. mRNA的核糖體結合位點上，含有SD序列Shine-DalgarnoSDsequence:1. 外源基因不能帶有內含子2. 普通用cDNA，不能直接用真核基因組DNA3. 必需利用原核細胞的強啟動子和 SD序列等調控元件控制外源基因的表達4. 利用宿主細胞的調控系統，調理外源基因的表達，防止外源基因的表達對宿主菌的毒害為何？二

3、、原核表達系統的本卷須知三、原核生物基因表達的調控大腸桿菌基因表達載體根本構造特征是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。 大腸桿菌的一切啟動子中都有兩段一致順序consensus sequence。 1. 啟動子TTGACA TATAAT 轉錄起始位點17bp5 核糖體結合位點-35 Box 和 -10 Box2. 核糖體結合位點 RBSShine-DalgarnoSD sequence翻譯起始階段，與核糖體16sRNA的3端相互作用，正確定位起始密碼子SD 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCASD序列間隔AUG的間隔影響翻譯3. 轉錄終止子 在表達

4、載體克隆位點的下游普通設計一段轉錄終止子，mRNA轉錄終止信號。四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位包涵體inclusion body 是存在于細胞質中的一種不溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體構造物。1. 細胞質中表達 在大腸桿菌細胞內表達人生長激素human growth hormone, hGH。例： 使重組蛋白易于分別、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。 優點缺陷周質periplasm 革蘭氏陰性菌位于內膜和外膜之間的細胞構造部分。優點：2. 周質中表達 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。由于需求穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質到培育基中，效果都不太理想。

5、用溶血素基因構建分泌性交融蛋白 使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培育基中。或與細菌素釋放蛋白共表達3. 胞外表達1一致順序1. 啟動子的構造對表達效率的影響五、影響外源基因表達效率的要素TTGACA TATAAT 轉錄起始位點17bp5 核糖體結合位點-35 Box 和 -10 Box 2-35區與-10區之間的間隔間隔為17bp時，啟動子最強。3-35區和-10區的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強。5-TTGACA TATAAT 一致順序lactrpPL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATAC

6、T 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box1SD序列2. 翻譯起始序列對表達效率的影響 翻譯起始階段，與核糖體16sRNA的3端相互作用，正確定位起始密碼子SD 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA SD序列間隔AUG的間隔影響翻譯5-UAAGGAGG-3 假設是AT，翻譯效率最高；假設是GC，效率只需50%或25%。 mRNA-rRNA互補區域長短影響基因的翻譯5-AGGAGGU-3 ？5-AAGGA-3 SD序列后面的4個堿基AUG左側的三個堿基也有影響 2起始密碼AUGAUG左側假設是

7、UAU或CUU時，最為有效；AUG右側的三個堿基也有影響。-半乳糖苷酶的mRNA中：是UUC、UCA或AGG時下降20倍。3. 啟動子與外源基因之間的間隔 轉錄終止區的存在保證載體不會轉錄非必需基因，不用浪費資源和能量、不會干擾正常表達。 添加載體的拷貝數會添加轉錄出的mRNA數目，添加表達效率。4. 轉錄終止區對表達效率的影響5. 載體拷貝數及穩定性對表達效率的影響6. 外源蛋白在菌體中的穩定性對表達效率的影響但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長轉錄程度的優化1運用強啟動子或誘導型啟動子2強終止子，或將兩個終止子串聯3提高mRNA的穩定性 如：在外源基因的下游插入“反復性基因外回文序列

8、六、提高表達程度常用的方法2. 翻譯程度的優化1優化翻譯起始區 起始密碼子ATG mRNA-rRNA互補區域長短， SD序列間隔AUG的間隔，及堿基種類 翻譯加強子2翻譯的終止 三個終止密碼子，防止核糖體騰躍 終止密碼子后的核苷酸類型，如UAAU為大腸桿菌最有效的翻譯終止序列。3密碼子的選擇 受體菌中共表達稀有密碼子tRNA基因 將稀有密碼子改為偏愛密碼子1表達分泌蛋白 細胞質外膜內膜周間質質粒染色體“外排：蛋白質從細胞質跨過內外膜到培育液中。 “分泌：蛋白質從細胞質跨過內膜到周間質中。3. 提高目的產物穩定性防止被宿主的酶降解。 運用次黃嘌呤核苷lon缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 大

9、腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌體的pin基因產物能抑制細菌的蛋白酶。可把pin添加到載體上。2 運用突變菌株，維護外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。1強啟動子提高轉錄效率；2運用高拷貝表達載體。 4. 質粒的拷貝數添加mRNA數量，提高核糖體與mRNA的結合速度宿主大量生長后，誘導載體質粒復制，添加拷貝數宿主大量生長時，抑制載體質粒的復制可調控的誘導型復制子1培育基2環境要素3誘導時間和劑量 5. 宿主菌的選擇表達載體與宿主相互匹配6. 培育條件優化1、缺乏翻譯后蛋白質的加工修飾系統，如糖基化、氨基酸修飾等。2、原核表達外源蛋白常以包涵體方式存在，必

10、需經過變性、復性處置才干獲得有生物活性的蛋白，并且其表達量非常低。七、原核細胞表達的缺陷4、原核細胞沒有轉錄后加工系統，無法識別內含子，故原核細胞無法表達沒有加工過的真核基因組。5、重組原核細胞在培育過程中產生的毒素難以排除，污染表達產物，影響產品純度。3、原核細胞中表達的真核蛋白不穩定，容易被細菌蛋白酶降解。七、原核細胞表達的缺陷1. 胰島素的構造及其生物合成2. 人胰島素的消費方法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建七、利用重組大腸桿菌消費人胰島素1. 胰島素的構造及其生物合成SSSSCNSSB 肽30C 肽31A 肽21RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內的特異性肽酶NC信號肽B

11、肽C 肽A 肽信號肽酶2. 人胰島素的消費方法1直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分別純化的，由于原料供應的限制，其產量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。2化學合成法制人胰島素 根據人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。這條化學全合成的道路從技術上來說是可以做到的，但其消費本錢奇高，從而也限制了產品的廣泛運用。2. 人胰島素的消費方法迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法：3化學轉型法制人胰島素 豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個氨基酸的差別，豬的為Ala，人的為

12、Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉化為人胰島素不失為一種選擇。2. 人胰島素的消費方法迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法：2. 人胰島素的消費方法迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法： 上述思緒的技術道路是：在pH為6-7的有機相中使胰蛋白酶催化其逆反響，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來，所構成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團，最終獲得人胰島素。該過程的總轉化率為60%，但工藝道路耗時，分別純化操作復雜，產品的價錢不菲。3化學轉型法制人胰島素2. 人胰島素的消費方法迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法： 1982年，美國Ely Li

13、Li公司首先運用重組大腸桿菌消費人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌消費人胰島素的新工藝。4基因工程法制人胰島素 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應對才干、降血糖作用、血漿藥代動力學等目的上均與天然胰島素沒有任何區別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優點，充分展現了基因工程在生物醫藥領域中的宏大潛力。2. 人胰島素的消費方法迄今為止，有四種大規模消費人胰島素的方法：4基因工程法制人胰島素3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建1A鏈和B鏈分別表達法化學合成:A、B鏈的編碼序列表達產物的

14、后處置道路：1A鏈和B鏈分別表達法消費技術的評價： 由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只需10% - 20%，因此采用這條工藝道路消費的重組人胰島素每克本錢高達100美圓以上。 為了進一步降低消費本錢，美國Ely LiLi公司隨后又建立了第二條消費重組人胰島素的工藝道路。1A鏈和B鏈分別表達法2人胰島素原表達法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建2人胰島素原表達法表達產物的后處置道路：二硫鍵的正確配對率相應提高，折疊率高達80%以上。雖然這條工藝道路并不比AB鏈分別表達法更為簡捷，而且還要運用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣

15、的缺陷，使得每克最終產品的本錢僅50美圓。目前美國Ely LiLi公司采用此工藝年產十幾噸的重組人胰島素。2人胰島素原表達法消費技術的評價：3A鏈和B鏈同時表達法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建4分泌型重組人胰島素表達法 上述三種重組大腸桿菌的構建道路均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產生的交融型重組蛋白表達率高、穩定性強，但不能分泌，只需以包涵體的方式存在于胞質中。3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 一種能促進交融蛋白分泌的工程菌構建戰略，是將胰島素或胰島素原編碼序列與b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的

16、工程菌同時具備了穩定高效表達可分泌型交融蛋白的優良特性，為胰島素的后續分別純化工序減輕了負擔。4分泌型重組人胰島素表達法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建第二節 外源基因在真核細胞中的表達酵母菌、植物原生質體、動物培育細胞等。真核或病毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因一、真核生物表達的優越性和必要性1、真核生物具有轉錄后加工系統，可識別并刪除基因中的內含子，剪切加工為成熟mRNA2、具備完善的翻譯后加工系統，可進展糖基化、乙酰化等修飾，使蛋白構成正確的天然構型，因此真核生物表達系統產生的蛋白更接近天然形狀，有利于其功能、生物活性的研討。3、某些真核細胞可將基因表達產物分泌到細胞培

17、育液中，簡化了純化工藝，降低了消費本錢。4、另外，真核生物表達的調控方式非常復雜，有助于我們深化了解基因調控機制。一、真核生物表達的優越性和必要性一 外源基因在酵母中表達二植物細胞表達系統三昆蟲培育細胞表達系統四 哺乳動物細胞表達系統二、真核生物表達系統一外源基因在酵母中表達酵母菌表達外源基因的優勢酵母轉化和表達的普經過程在啤酒酵母中表達的重組蛋白廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌 利用重組酵母消費乙肝疫苗1. 酵母菌表達外源基因的優勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便；具有原核細菌無法比較的真核蛋白翻譯后加工系統；曾經分別出很強的啟動子；能將外源基因表達產物分泌至培育基中；生

18、長迅速、大規模發酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、本錢低廉；不含有特異性的病毒、不產內毒素,美國FDA認定為平安的基因工程受體系統。酵母原生質體感受態酶去壁CaCl2 PEG整合到染色體上或獨立在酵母細胞內轉化Ura3+營養缺陷型 培育基挑選轉化子克隆生長帶有目的基因的重組載體鑒定克隆發酵表達外源基因產物分別、純化2. 酵母轉化和表達的普經過程 將目的基因克隆至載體1. 基因及載體分別用限制酶切割；2. 回收切割的基因和載體，然后用T4 DNA銜接酶銜接；3. 將構建的重組質粒轉化至大腸桿菌受體菌；4. 提取重組質粒DNA，酶切鑒定重組質粒，挑選出陽性重組菌株。HIV-1抗原丙肝病毒蛋白診斷試劑

19、HIV-1外殼蛋白瘧原蟲環子孢子蛋白乙肝病毒外表抗原疫苗稱號種類凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶 集落刺激因子成纖維細胞生長因子胰島素前體血小板源生長因子類胰島素生長因子胰島素上皮生長因子人類治療用蛋白藥物3. 在啤酒酵母中表達的重組蛋白4. 廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌酵母屬 如釀酒酵母克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母漢遜酵母屬 如多態漢遜酵母 其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研討最為詳盡， 但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗1乙型肝炎病毒的構造蛋白包裹的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒顆粒呈球面狀，直徑

20、為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要構造蛋白是病毒的外表抗原多肽HBsAg或S多肽。顆粒內的蛋白成份包括中心抗原 HBcAg 、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。1乙型肝炎病毒的構造除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗2乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗 乙肝病毒在體外細胞培育基中并不能繁衍，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。雖然這種質膜來源的疫苗具有較高的免疫原

21、性，但由于原資料的限制難以大規模產業化。3傳統乙肝疫苗的制備5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗4產乙肝外表抗原的重組釀酒酵母 20世紀80年代開場選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉化子能表達出具有免疫活性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的方式存在，平均顆粒直徑為 22 nm，其構造和形狀均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒一樣。5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗 目前，由釀酒酵母消費的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化，重組產物的最終產量可達細胞總蛋白量的1%2%。進一步的研討闡明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者或兩者構成的

22、復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對S抗原缺乏呼應的人群的免疫反響。4產乙肝外表抗原的重組釀酒酵母5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗5產乙肝外表抗原的重組巴斯德畢赤酵母重組菌經甲醇誘導表達HBsAg，最終S蛋白的產量可達細胞可溶性蛋白總量的23%，在大規模的消費過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發酵罐中培育，最終可獲得90克 22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。5產乙肝外表抗原的重組巴斯德畢赤酵母5. 利用重組酵母消費乙肝疫苗二植物細胞表達系統1. 植物受體系統的特點1細胞具有全能性2光協作用，培育條件簡單，消費本錢低3表達產物具有免疫原性和生物活性4靈敏性及適用性強5穩定的外植體來源2. 在植物種類改良中的運用1控制果實成熟 乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經氨基環丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。2抗病蟲害的轉基因植物 蘇云金芽孢桿菌的BT基因、蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多個。 3抗除草劑的轉基因植物 抑制農作物對除草劑的吸收、降低敏感性靶蛋白對除草劑分子的親和性4抗