1、生物樣品制備生物樣品制備一一 生物樣品采集及細胞破碎生物樣品采集及細胞破碎生物樣品指： 植物的花、莖、葉、根、種子 動物的體液：尿、血、唾液、膽汁、胃液、淋 巴液、其他分泌液 毛發、肌肉、組織器官； 各種微生物。1 1 生物樣品采集生物樣品采集1.1采樣工具 生物樣品采集與自然界中其他樣品采集不同，可以用：v 注射器吸取v 手術刀、剪切割1.2 1.2 注意事項注意事項 采樣要有代表性(體液：幾L ，器官組織：幾 mg); 采樣時機； 采樣部位準確； 采樣后應立即加以處理，如采好血樣后立即加抗血凝劑，組織器官加防腐劑，動物樣品速凍處理，植物樣品脫水處理。 采用工具需消毒，最好經過無毒處理。2

2、細胞破碎2.1 目的 破壞細胞外殼，使細胞內含物有效地釋放出來。即：將生物體細胞內及多細胞生物組織中的待測組分(如激素、酶、基因工程產物等)充分釋放到溶液中。不同的生物體同一生物體的不同組織 不同細胞破碎方法 v 比較柔軟的組織（胰臟、肝臟、腦組織）：普 通勻漿器研磨v 植物肉組織：一般研磨v 含纖維多的植物組織：組織搗碎器搗碎或加砂 研磨v 具有堅韌細胞壁的微生物：自溶、冷熱交替、 加砂研磨、超聲波或加壓處理。2.2 實驗室中常用細胞破碎方法細胞破裂機械法 非機械法液體剪切 固體剪切 脫水 溶胞作用超聲波 機械攪 研磨 壓力 拌壓力 桿、臼 Hughes 球磨機 壓榨機 X壓榨機物理的 化學

3、的 酶的溶菌空氣干燥真空干燥冷凍干燥溶劑干燥滲透沖擊 陽離子和 酶和有 壓力釋放 陰離子 關的酶凍結 洗滌劑 噬菌體和融化 抗生素 溶胞 甘氨酸 抗菌素(1)(1)機械法機械法原理原理：通過機械切力的作用使組織細胞破碎。v高速組織搗碎機：動物組織內臟、植物肉質種子、柔嫩的葉、菜籽材料破碎。樣品配成稀糊狀液，裝1/3 體積v玻璃勻漿器：細胞破碎程度比高速組織搗碎機高, 機械切力對生物大分子破壞少。v研磨：細菌和植物材料，加玻璃砂效果更好。( (2) 2)物理法物理法原理：原理：通過各種物理作用使組織細胞破碎。v反復凍融法：適于大部分動物細胞及細胞內的 顆粒破碎。 方法：待破碎樣品冷至1520 使

4、 之凍固，然后緩慢融化。v冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核 酸。 方法：材料在90 左右維持數分鐘，立即 置于冰浴中使迅速冷卻，以破壞絕 大多數細胞。v超聲波處理法： 多用于微生物材料 處理效果與樣品濃度和使用頻率有關 注意避免溶液中沉淀存在 對超聲波敏感的核酸和酶慎用v加壓破碎法：加水壓或氣壓，當壓力達到2035 MPa 時，90以上的細胞被壓碎。(3)化學及生物化學法原理：通過化學試劑或酶破壞細胞壁使細胞破 碎。v自溶法：新鮮生物樣品在一定的pH和溫度下，利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。 動物樣品一般04 ； 微生物：室溫。 加入甲苯、氯仿可以防止外界細菌

5、污染。v酶處理： 溶菌酶可以專一性地破壞細菌細胞壁； 蝸牛酶也可以破壞細菌細胞； 纖維素酶常用于破壞植物細胞。v 表面活性劑處理法： 常用的有：十二烷基磺酸鈉 氯化十二烷基吡啶 去氧膽酸鈉v其他方法：改變細胞膜透性、破壞蛋白質與脂類結合等。如真空干燥、制成丙酮粉。注意：注意： 無論用哪一種方法破碎細胞，都需要在一定的 稀鹽溶液或緩沖溶液中進行； 一般還需加入保護劑防止生物大分子變性和 降解。二二 生物大分子的提取與蛋白質的去除生物大分子的提取與蛋白質的去除 1、生物大分子的提取1.1 生物大分子是指在分子量在數千到數百萬的大分子。主要包括多肽、蛋白質、酶、核酸、多糖等，在細胞破碎時被充分釋放出

6、來。為了將它們制備成色譜分析的樣品需要用一定的溶劑將它們抽提出來，與細胞殘渣分離。生物大分子大部分可溶于水或含有少量酸、堿、鹽的水溶液。有時也加入一些有機溶劑改善欲測組分的提取效率，并使欲測組分與其他組分分離，以便于色譜分析。1.2 生物大分子提取條件影響提取的因素較多，要根據經驗，結合具體實驗條件，選擇最佳條件和方法，達到提取的最佳效果。影響生物大分子提取的主要因素： 溶劑性質 pH值 離子強度 介電常數提取溫度等。(1)溶劑的選擇v常用水以及稀鹽、稀堿、稀酸溶液，有的用 不同比例的有機溶劑，如乙醇、丙酮、氯 仿、四氯化碳等;v 一些與脂質結合比較牢固或分子中非極性 側鏈較多的蛋白質和酶，常

7、用丁醇提取效果 較好(丁醇親脂性強，兼親水性，可取代蛋白質 結合的脂質位置，還可阻止脂質重新與蛋白質分 子結合，使蛋白質在水中的溶解能力增加);v選擇溶劑時注意:極性物質易溶于極性溶劑；非極性物質易溶于非極性有機溶劑中；堿性物質易溶于酸性溶劑；酸性物質易溶于堿性溶劑；溫度升高時溶解度相應增大；遠離等電點時溶解度增加。(2) pH值 pH值的選擇與溶解度、穩定性有很大關系。 一般在穩定的范圍內，選擇在偏離pI的兩側。 如細胞色素C和溶菌酶都屬堿性蛋白質，常用 稀酸提取。 提取時，某些蛋白質或酶與其他物質結合， 常以離子鍵形式存在，選擇pH=36=36范圍，對范圍，對 分離離子鍵有利分離離子鍵有利

8、 注意測量pH值的準確性，誤差不應超過0.1。 （3）溫度 一般提取溫度在5以下，但對溫度耐受力較 高的欲測組分，可適當提高提取溫度，使得某 些雜蛋白質變性分離，有利于提取和下一步的 色譜分析。如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許 多多肽激素，選擇在37 50下提取，效果比 低溫提取更好。 2 2 蛋白質的去除蛋白質的去除 蛋白質的存在常常干擾生物樣品中的一些小分子化合物及一些多肽類化合物的分析，需要在制備色譜分析樣品時將這些蛋白質除去。常用的除蛋白質方法有： 加熱法 鹽析法 有機溶劑沉淀法 等電點沉淀法 膜分離法凝膠層析 （1 1）加熱法）加熱法 當欲測組分熱穩定性好時，可采用加熱的方 法將一些熱

9、變性蛋白沉淀； 加熱溫度視欲測組分的熱穩定性而定，通常 可加熱到90。 蛋白沉淀后可用離心或過濾除去； 加熱法最簡單，但只能除去熱變性蛋白。 (2) (2) 鹽析法鹽析法 原理：利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶 解度不同程度的降低來沉淀除去蛋白質。 在低鹽濃度下，蛋白質溶解度隨著鹽濃度升 高 而增加鹽溶作用； 當鹽濃度不斷升高時，不同蛋白質溶解度又以 不同程度下降，并先后析出沉淀鹽析作用。（這是蛋白質分子內及分子間電荷的極性基團的靜電引力造成的。由于水中加入少量鹽，增加了溶液的極性，減弱了蛋白質分子間的作用力，促使其溶解度增大。當鹽濃度增加到一定程度時，水活度被降低，蛋白質表面的電荷大量被中

10、和，水化膜被破壞，蛋白質分子又相互聚集而沉淀析出。） 鹽析法的優點： 對設備和條件要求低，安全，應用范圍廣泛； 一般可在室溫下操作； 常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、 氯化鈉、磷酸鈉等。 硫酸銨的鹽析能力強，飽和液濃度大，溶解 度受溫度影響小，一般不會使蛋白質變性。 但緩沖能力差，pH值常在4.55.5間。 鹽析注意事項鹽析注意事項鹽的飽和度影響鹽的飽和度是影響蛋白質鹽析懂得重要因素，不同的蛋白質鹽析所要求的飽和度不同。pH值的選擇蛋白質在等電點（pI）時的溶解度最小，最易從溶液中沉淀析出，因此進行鹽析時的pH值應選擇在被沉淀蛋白質的pI附近。蛋白質濃度的影響在相同鹽析的條件下，蛋白質濃

11、度越大越易沉淀。 溫度的影響一般可在室溫下進行。 （3 3）有機溶劑沉淀法）有機溶劑沉淀法 蛋白質的沉淀與溶解，與溶劑的介電常數有關。 降低溶液的介電常數，能增加蛋白質分子上不 同電荷的引力，使其溶解度變小，同時還破壞蛋白質的水化膜而使蛋白質沉淀析出。 乙醇和丙酮是最常用的有機溶劑，丙酮的介電常數小于乙醇，故沉淀的能力較強。常用的蛋白質沉淀劑的蛋白質沉淀效率常用的蛋白質沉淀劑的蛋白質沉淀效率 沉淀劑 上清液pH 沉淀0.5ml血漿中95%以上蛋 白時所需沉淀劑體積/ml 三氯醋酸（0.1g/ml） 1.42.0 0.2 高氯酸（0.06g/ml） 1.5 0.2 鎢酸 2.23.9 0.6焦磷

12、酸（0.05g/ml） 1.62.7 0.4硫酸銅鎢酸鈉 5.77.3 1.0氫氧化鋅 6.57.5 1.5硫酸銨 7.07.7 2.0乙腈 8.59.5 1.0丙酮 910 1.0乙醇 910 1.5甲醇 8.59.5 1.5(4) (4) 等電點沉淀法等電點沉淀法 利用蛋白質在等電點時溶解度最低，用酸、 堿調pH，可使蛋白沉淀析出， 但等電點沉淀法沉淀不完全，可與有機溶劑 沉淀法，鹽析法聯合使用。 (5) (5) 膜分離法膜分離法膜分離技術可將欲測小分子化合物和大分子的蛋白質很好分離。包括: 超濾 反滲透析 電滲析 微孔過濾 氣體滲析 超精密過濾等。v 超濾是一種除去樣品中蛋白質和其他大分

13、 子的方法，利用分子分離的薄膜分離技術， 依靠薄膜兩側壓力差作為推動力來分離溶 液中不同分子量的物質。v 超濾膜的制作材料有醋酸纖維素、聚酰胺、 聚砜等，其中醋酸纖維素最常用。 v與沉淀法相比，超濾的優點在于適用于小量 樣品，不用稀釋樣品也不用改變樣品的pH 值，尤其適用于對酸堿不穩定的化合物特 別是欲測組分易被某種酶分解時用超濾可除 去該酶，避免欲測物分解。v 但超濾可能會由于欲測組分結合在膜上面影 響回收率。 （6 6）凝膠層析）凝膠層析 利用分子大小不同的物質在流過凝膠固定 相的保留時間不同，大分子首先流出，小分子最后流出，可將欲測小分子化合物與大分子蛋白質分離。 由于欲測小分子化合物的

14、濃度被流動相所 稀釋，必要時還要進行濃縮后再用色譜分析。（7 7）柱層析）柱層析 用能吸附蛋白質的材料裝填成小柱，使欲測蛋 白質的樣品流過小柱，樣品中的蛋白質被柱填 料吸附，欲測組分不被吸附，從小柱中流出。 這種小柱稱為預柱。 預柱可以直接連在HPLC的進樣裝置上，含蛋 白質的樣品通過預柱后可直接HPLC系統分析。 如分析尿中的某些代謝產物時，可將樣品通 過預柱，除去蛋白質，直接進入HPLC分析。(8)(8)高速離心高速離心原理：高速離心是根據物質沉降系數、質量、 浮力因子等不同，應用強大的離心力使物質分 離、濃縮、提純的方法，是生物樣品制備中常用的分離方法之一。在高速離心時蛋白質等生物大分子

15、將首先沉淀在 離心管底部，不同分子量的蛋白質等生物大分子沉降速度不同，也可按分子量大小沉降在離心管的不同位置，這樣就可以從離心管的不同位置取出樣品進行色譜分析。注意：注意：v在選擇蛋白質的方法時要考慮欲測小分子 化合物的性質化合物的性質，所需除去的蛋白質的性質 及色譜分析時使用何種色譜技術；v最好是使用加熱法、有機溶劑沉淀法、膜 分離方法和柱層析法。（不會引入新的干擾化合物，而鹽析法將引入高濃度的鹽，當這些鹽對下一步色譜分析不干擾時可考慮鹽析法，否則在除去了蛋白質后還要消除鹽的干擾。）三三 微透析技術微透析技術v微透析(microdialysis)技術起源于世紀 年代，目前微透析技術在用色譜分

16、析， 特別是用毛細管電泳分析生物樣品時得到了 廣泛的推廣和 應用。v微透析技術實質上是一種膜分離技術膜分離技術，是 一種利用膜透析原理，微量地微量地對細胞液進細胞液進 行流動性連續采樣行流動性連續采樣的新型采樣和色譜樣品制 備技術。v 微透析探針很細微透析探針很細，可以在不破壞生物體內環 境的情況下，直接插到生物活體需采樣的部 位進行采樣，并不影響生物體的生命，所以 微透析技術可以用來研究生物體在活動時體可以用來研究生物體在活動時體 液組成的一些變化液組成的一些變化。 3.1 3.1 原理原理 微透析是一種在不破壞（或破壞很少）生 物體內環境的前提下，對生物體細胞液的 內源性或外源性物質進行連

17、續取樣和分析。 將由膜制成的微透析探針植于需要取樣的部位用與細胞間液非常接近的生理溶液以慢速度（ 0.5 5L/min）灌注探針由于膜內外欲測組分的濃度差而使得膜外的體 內欲測組分進入膜內，并被灌注液帶到體外， 進入儀器，如毛細管電泳，微柱HPLC等等，進 行分析。 控制取樣條件恒定，灌注液的組成和流速恒定， 則微透析的回收率保持一定。 微透析探針由膜，導管及套管等部分組成， 探針的長度一般在0.5 10mm，膜材料常用纖 維素膜、聚丙稀腈膜和聚碳酸脂膜，這些膜完 全不具有化學選擇性，小分子進出膜完全由膜 孔大小所決定。 3.2 3.2 回收率校正回收率校正微透析技術在定量分析中最重要的工作是

18、確定透析探針的回收率，這也是利用微透析技術進行定量分析的理論基礎。定義:流出灌注液中欲測組分的濃度（d）與探針膜外細胞間液中欲測組分的濃度（o）之比稱為微透析回收率。%100CoCdR影響透析探針的回收率的因素： 膜的長度 膜的幾何形狀 灌注液流速 欲測組分的性質 取樣時的溫度透析的過程實質上是一個濃度擴散過程，當透析探針剛剛植入體內細胞間液時，欲測組分對膜內外而言，是一非平衡狀態。由于欲測組分不斷透過膜，由膜外進入膜內，使得Cd在不斷增加。當Cd增加到某一值時，即透析探針植入一定時間后，透析過程達到平衡，Cd也不再繼續增加，達到一恒定值。這時透析探針的回收率保持一常數。體內校正回收率的方法(1)內標法:在灌注液中加入已知濃度且性質與欲測組分相似的另一物質作內標，測其滲出（即內標由膜內透析到膜外）率作為欲測組分的回收率。要求：內標物不僅在擴散性質上與欲測組分一致，而且還要在體內代謝過程也盡可能一致。(2)低灌注流速法灌注液