1、緒論1. 生物技術：以生命科學為基礎，利用生物體系和工程學原理生產生物制品和創造新物種的一門綜合技術。主要包括細胞工程、基因工程、發酵工程、酶工程、蛋白質工程、生化工程。2. 細胞工程是指應用細胞生物學、發育生物學、遺傳學和分子生物學等方法，通過類似于工程學的步驟，在細胞或細胞器水平上按照人們的醫院來改變下包內的遺傳物質，以獲得新的生物物種、品種或特種細胞產品的一門綜合性技術。3. 細胞工程主要研究內容：1）動植物細胞與組織培養：主要包括細胞培養、組織培養和器官培養。2）細胞融合3）染色體工程：按人們的需要來添加、削減或替換染色體的一種技術。主要用于新品種的培育。4）胚胎工程：主要針對動物。包

2、括胚胎分割、胚胎融合、細胞核移植、體外受精、胚胎培養等。5）細胞遺傳工程：主要包括動物克隆和轉基因技術。4. 細胞工程的應用：1）植物方面的應用：微繁殖技術的應用、細胞大量培養與有用代謝產物生產、單倍體技術的應用、胚培養、原生質體培養、轉化。2）動物方面的應用：快速繁殖優良、瀕危品種及新品種；利用動物細胞培養生產活性產物、藥品；供醫學器官修復或移植的組織工程；轉基因動物的生物反應器。3）細胞工程在能源、環境保護等領域的應用第一章組織培養的基本設備和基本方法1. 植物細胞工程（plant cell engineering）:一種在細胞水平上進行遺傳操作的生物技術，它以植物細胞為對象，通過離體培養

3、，實現植物個體快速繁殖、品種改良或有效成分的生產和應用的目的。研究內容：（1）器官培養（organ culture）：指對植物根、莖、葉、花、果實以及各部原基（芽原基、根原基）的培養。（2）胚胎培養（embryo ）：指以胚珠、幼胚、成熟胚（包括胚乳）為材料的離體培養。（3）組織培養（tissue ）：指以植物各部分組織為材料的離體培養，如莖組織、葉肉組織、根組織、中柱鞘、形成層、髓組織等。（4）細胞培養（cell ）：指以能保持較好分散性的植物細胞或很小的細胞團為材料進行的離體培養。（5）原生質體培養（protoplast ）：指對脫除細胞壁的裸露細胞的培養，使其在特定培養基上重新形成細胞壁

4、，并繼續分裂、分化形成完整植株。2. 基本培養基：培養基由無機營養（大量元素、微量元素）、有機營養（碳源、維生素、氨基酸）和激素這幾大類成分構成。不含有激素的培養基稱為基本培養基，如常用的基本培養基有MS、LS、AA、SH培養基等。培養基的基本成分：（1）無機營養（大量、微量）（2）有機營養（碳源、氮源、生理活性物質）（3）植物激素：生長素類（IAA、IBA、NAA）、細胞分裂素類（KT、BA、ZT）、其他類（GA3、ABA、乙烯）。（4）附加物類：瓊脂、活性炭、蛋白水解物等。3. 培養基的滅菌方式：高溫消毒、過濾消毒4. 常用的滅菌方法：1）干熱滅菌法：利用鼓風機干箱進行烘烤滅菌。適用于各種

5、玻璃器皿和器械的滅菌消毒。2）濕熱滅菌法：利用高壓蒸汽滅菌的方法。適用于培養基、蒸餾水、各種器械等物品滅菌。3）熏蒸滅菌法：利用藥物熏蒸以達到滅菌的目的。適用于接種室和培養室的滅菌。4）過濾滅菌法：指用細菌過濾器進行滅菌的方法。使用的濾膜孔徑在0.30.45um范圍內。5）藥劑滅菌法：指采用一定濃度的化學藥品進行滅菌的方法。如氯化汞、漂白粉等。6）燒灼滅菌法：指用酒精燈燒灼進行滅菌的方法。適用于接種器械、瓶口、瓶塞的滅菌。7）照射滅菌法：指用紫外燈照射進行滅菌的方法。適用于接種室內和工作臺面的消毒滅菌。植物材料的消毒方式：次氯酸鈣、次氯酸鈉、過氧化氫、氯化汞等。 植物材料進行消毒處理后，必須用

6、無菌水沖洗34次，以清除消毒的殘留。第二章 植物細胞的全能性與脫分化、再分化1. 植物細胞全能性（totipotent）：指植物細胞具有該植物體全部遺傳信息，在一定條件下如同受精卵一樣，具有發育成完整植物體的潛在能力，包括兩種含義：1)植物細胞無論是生殖細胞還是體細胞，均具有該物種全部的遺傳信息；2）每個植物細胞均具有發育成完整植物體的潛在能力。離體培養條件下植物細胞全能性實現的途徑：以植物體細胞為材料，植株有兩套染色體，可正常開花；以性細胞為材料，含單套染色體組，不能正常開花；以原生質體為材料；通過某種方式促進不同的原生質體融合，得雜種植株；外源基因導入植物細胞。2. 細胞分化（differ

7、entiation）指由于細胞的分工而導致的細胞結構和功能的改變，或發育方式改變的過程。3. 胚性細胞(embryogenic cells）：能夠在離體環境下增殖，能夠分化發育成完整的植株的細胞。4. 細胞脫分化（dedifferentiation）：指在離體培養條件下，分化細胞失去其原有分化的典型特征，轉變為分生狀態或胚性狀態的現象。條件：創傷和外源激素。第三章 影響植物細胞脫分化和再分化的因子1.影響植物細胞脫分化和再分化的因子：主要包括內因和外因兩個方面。內因：主要指植物的遺傳特性和生理狀態。；外因：主要包括植物細胞營養條件（無機營養、有機營養、植物激素、天然提取物等）和環境條件（滲透壓

8、、酸堿度、溫度、濕度、光照等）。2.常用的植物激素有哪些？各有什么作用？1）生長素：IAA、IBA、NAA等。作用：促進細胞分裂和伸長；使頂芽保持頂端優勢；刺激生根；加速木質部導管的形成；防止葉片的脫落。2）細胞分裂素：KT、6-BA、ZT等。作用：促進細胞的分裂和器官的形成；終止種子和芽的休眠；打破頂端優勢；延遲葉片衰老；增加酶活性；促進物質運輸；提高機體的抗逆性。3）赤霉素（不耐高溫）作用：促進細胞的伸展和莖葉的伸長；誘導長日照植物提前開花；促進果實發育，誘導單性生殖等；誘導某些酶的合成；打破種子或器官的休眠。4）乙烯作用：加速果實的成熟和組織的老化。5）脫落酸作用：促進芽和種子進入休眠狀

9、態；促進某些短日照植物提前開花等。第四章 植物組織培養與快速繁殖1. 植物的繁殖方式：1）有性繁殖：指植物通過開花、傳粉、受精和產生種子的繁殖過程。2）無性繁殖：指植物的營養生長到一定時期，就進入生殖生長階段，產生具有生殖功能的細胞，這些細胞不經兩性結合，可直接發育新個體的繁殖方式。3）營養繁殖：屬于無性繁殖。2. 微繁殖技術：以植物的器官、組織、細胞或原生質體為外植體，在立體培養條件下快速進行植株再生的技術。微繁殖技術用途：1）克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的后代嚴重分離；2）名優植物或瀕危植物的快速繁殖；3）無病毒苗木生產；4）單獨繁殖雌株或雄株；5）種質資源保存。3.舉例說明微繁殖技術

10、的過程?（紅豆杉的芽培養與快速繁殖）：1）取材及低溫預處理：從優良的成年樹或扦插苗上采取枝條，放入4的冰箱中處理4天，備用。；2）消毒處理；3）外植體的制備及接種培養；4）繼代培養及褐化的防止；5）壯芽培養；6）生根培養4. 愈傷組織：脫分化后的細胞，經過分裂，產生無組織結構、無明顯極性的細胞團稱為愈傷組織。其細胞大而不規則，高度液泡化，沒有次生細胞壁和胞間連絲。外植體：指植物組織培養中用來進行離體無菌培養的材料的切塊或切斷（如子葉的切塊、胚軸切段、莖段等），也可以是器官、組織、細胞和原生質體。繼代培養：外植體在培養基上培養一段時間以后，培養基的營養物質不足、水分散失，并且積累一些代謝產物，需

11、將培養物轉到新的培養基上繼續培養，這種轉移培養的過程稱為繼代。5. 當前植物脫病毒的方法主要有：莖尖培養脫毒法、高溫和低溫處理脫毒法、化學處理脫毒法、微體嫁接離體培養脫毒法、株心組織培養脫毒法等、蒜臺圓盤培養脫毒法。6.莖尖培養脫病毒的原因：能量競爭；傳導抑制；激素抑制；酶缺乏造成抑制；抑制因子存在影響因素：第五章 胚胎培養1.胚培養包括幾種？成熟胚培養：將成的種子通過表面滅菌，在超凈工作臺上解剖種子，取出胚，接種在培養基上，在常規條件下進行培養即可萌發形成完整植株。幼胚培養：幼胚在胚珠中是異養的，培養時須通過培養基提供足夠的營養和適宜的培養條件2. 影響幼胚培養的因素：胚胎發育時期、培養基、

12、培養條件3. 抑制幼胚提前萌發的措施：1）提高培養基的滲透壓。提高培養基中蔗糖的濃度（高于10%），或加入甘露醇，部分地代替蔗糖。2）加入0.010.2mg/L的ABA和200500mg/L的酪蛋白水解物。其中ABA的作用在于抑制幼胚的吸水過程，是胚胎逐漸脫水干燥，發育為形態正常的成熟胚，然后產生健壯的幼苗。3）將培養物在高溫（32）和強光條件下培養。4.胚培養的應用：拯救雜種胚，獲得稀有雜種；單倍體的產生；打破種子休眠，縮短育種周期；稀有植物的繁殖5.胚乳培養的應用前景如何？P1106.離體受精：將精子及卵細胞分離出來，在體外融合成受精卵的過程過程：精子的分離，卵細胞的分離，精卵離體的融合，

13、合子離體培養7. 影響胚狀體發生的因素：供體植物的基因型、外植體的來源和培養物的生理狀況、與胚狀體發生相關基因的表達、培養基中外源激素、培養基的氮源、天然提取物和活性炭對胚狀體形成的作用。8. 人工種子：將植物組織培養產生的胚狀體包裹上用有機化合物和營養物質制作的人工種皮，即為人工種子。制作過程：1）胚狀體同步發育的控制；2）人工種皮的研制；3）人工胚乳；4）胚狀體的包埋。特點：具有發育良好的體細胞胚，并能發育成正常的完整植株；具有人工胚乳可提供種胚發育的營養；具有能引起保護作用的人工種皮。9. 胚珠培養：將胚珠從子房中剝離出來進行培養，然后將花粉授在胚珠的珠孔端，可實現雙受精，獲得健康的種子

14、。第六章 花藥培養1. 藥培養的一般程序：1）取材：從植株上取花藥單核期的花蕾或幼穗。2）預處理：在保濕條件下低溫預處理。3）消毒：對花藥進行常規表面消毒。4）接種及培養：將花藥接種到合適的培養基上，在適宜溫度下進行培養。5）植株再生：將花粉胚或花粉愈傷組織轉入再生培養基中，進行植株再生培養。6）染色體加倍：在試管階段或移栽成活后，采用秋水仙素處理等方法對花粉植株的染色體加倍。2.影響花藥培養的因素：1）供體的基因型；2）供體植株的生理狀況；3）花粉的發育時期；4）材料的預處理和預培養；5）培養基；6）培養方式；7）培養條件4. 單倍體在植物遺傳育種中的作用：1）控制雜種分離，縮短育種周期；2

15、）提高常規育種的選擇效率；3）單倍體是誘變育種的良好材料；誘導單倍體的途徑：1）自然界自發單倍體發生孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵細胞（大孢子）分裂形成單倍體胚，進一步發育成單倍體植株。孤雄生殖：傳粉后卵細胞退化消失，由精細胞發育成單倍體植株。無融合生殖：由胚囊中卵細胞之外的其他細胞發育成單倍體植物。體細胞減數分裂：體細胞減數分裂的幾率很小，只是偶爾發生。2）人工誘導單倍體的途徑：孤雄生殖：離體培養花藥或花粉，誘發小孢子發育成單倍體植物。孤雌生殖：離體培養未受精的子房或胚珠，誘發卵細胞發育成單倍體植株。第七章 原生質體培養與體細胞雜交1. 原生質體：指去掉細胞壁的單細胞，它是離體培養條件下能夠再

16、生完整植株的最小單位。2. 分離原生質體的方法：1）機械分離法：能避免酶制劑對原生質體的破壞作用，但產量少；2）酶解分離法影響原生質體活力的因素：酶的種類和組合、滲透壓穩定劑、質膜穩定劑、pH值、溫度、植物材料的生理狀態。3. 培養方式有幾種？影響原生質體培養的因素是什么？原生質體培養方式：固體培養、液體淺層培養、雙層培養、微滴培養、滋養培養影響原生質體培養的因素：原生質體的活力、原生質體密度、細胞壁再生速度、培養條件4. 原生質體培養目的：原生質體融合，克服遠緣雜交障礙，實現體細胞雜交，產生雜交后代5. 原生質體的融合方式：1）自發融合:由于細胞間胞間絲的擴展和粘連，有些相鄰的原生質體間能彼

17、此自發融合。2）誘發融合：NaNO3誘導融合、高pH和高鈣離子誘導融合、PEG誘導融合、PEG與pH、高鈣離子相結合的誘導法、電擊融合。6. 同核體：同一親本原生質體自身融合即自體融合，得到同核體。異核體：由于不同種親本原生質體見發生融合即異體融合，得到異核體。7.如何對雜種細胞進行選擇？如何進行體細胞雜種的鑒定？選擇：互補選擇法（白化互補、遺傳互補）、利用對外源激素的要求不同進行選擇、利用生長習性和愈傷組織顏色不同進行選擇、根據原生質體形態機械分離雜種細胞、熒光染色標記法。鑒定：形態特征觀察、染色體數目和核型檢查、生物化學與分子生物學檢測。8. 體細胞雜交在農業生產中的應用：1）體細胞雜合形

18、成新物種2）體細胞雜交可培育抗病新品種3）胞質雜種在育種上的應用9. 滋養培養：是利用能夠分泌腎功能無活性物質的細胞或組織培養物作為滋養者，來促進原生質體的分裂和生長。10看護培養法：是指用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖11. 不對稱的細胞融合技術：使一個親本的原生質體和另一個親本的細胞質結合在一起雜種細胞：具有一個親本細胞核的兩個親本細胞質的體細胞雜種。胞質雜種細胞產生的途徑：正常原生質體+去核的原生質體；正常的原生質體+核失活的原生質體；融合后的某一個階段一個親本的核或染色體被排除。第九章 植物細胞培養1.植物細胞大量培養生產次生代謝產物：藥用代謝產物（苷類、甾醇

19、、生物堿、醌類、蛋白質類、有機酸等）、天然食物添加劑、殺蟲劑和殺菌劑。2.植物細胞大量培養的主要步驟：1）誘導植物產生旺盛生長的愈傷組織和懸浮培養：植物細胞懸浮培養是指在離體條件下，將于上組織或其他易分散的組織置于液體培養中進行振蕩培養，得到游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術。2）篩選高產細胞系；3）在生物反應器中大量培養細胞或細胞團3.成功的細胞懸浮系應當滿足的條件：懸浮培養物分散性好，細胞較小；均一性好；生長迅速4.簡述細胞懸浮培養過程中的生長動態：延遲期：由于細胞剛接種到一個新的環境，有一段適應期，細胞很少分裂或剛開始分裂；對數生長期：細胞生長旺盛，細

20、胞數目迅速增加；減緩期：由于培養和細胞衰老等因素的限制，細胞數目的增長速度減緩；靜止期：細胞分裂停止，數目恒定，此時營養物質耗盡，必須及時進行繼代培養，細胞死亡速度加快，細胞開始死亡，即衰亡期。5.高產細胞系篩選：1）根據細胞表型進行篩選；2)根據單克隆此生代謝產物的含量進行篩選保存：高產細胞系的超低溫保存6.影響植物細胞大規模培養的因素：光照、攪拌、通氣、培養基成分、接種量、脅迫因子、誘導子、前提物質第十一章 動物細胞與組織培養1. 與植物細胞相比,動物細胞培養有何特點?答:1)與植物細胞相比，動物細胞之間的連接形式復雜的多，主要有五種形式：緊密連接,間隙連接,隔壁連接,中間連接,橋粒連接；

21、2)動物細胞在體外培養時具有貼附,接觸抑制,密度依賴等特點.；3)動物細胞對營養要求更加苛刻,除一般營養外,還需要血清.；4)對培養環境適應性更差.；5)動物細胞生長緩慢,因此培養時間較長.與微生物細胞的不同點：動物細胞比微生物細胞大,無細胞壁.；動物細胞倍增時間長，生長緩慢，易受污染。；培養過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。；動物細胞主要以聚集形式存在。；原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡.2. 體外生長特點：貼附、接觸抑制、密度依賴3. 貼壁培養是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養.貼壁培養的材料:要求有靜電荷和高度的表面活性.主要的材料有:玻璃,塑料,金屬,微載體.貼壁培養的基本

22、操作:通過機械分散法或酶消化法將培養材料分散成細胞懸液過濾,離心,純化,漂洗后接種到適宜的培養基上. 放入二氧化碳培養箱中培養.貼壁生長的過程:游離期,吸附期,繁殖期,退化期.4. 細胞系：是由原代培養經初步純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。5. 動物細胞組織培養的方法主要有幾種方式?定義:動物細胞與組織培養是指從動物體內取出細胞或組織,模擬體內的生理環境,在無菌,適溫和營養充足等條件下,使離體細胞或組織生存,生長并維持結構和功能的技術.可分為原代培和傳代培養兩類.方式:動物細胞培養的傳統方法:懸滴培養法,旋轉管培養法,灌注小室培養法,培養瓶培養法,培養板培養法

23、.6. 原代培養：原代培養期是指從體內取出組織接種培養到第一次傳代培養這個階段,持續1-4周,此時期細胞比較活躍,有細胞分裂,但不旺盛；基本過程：接種與培養、常規檢查7. 動物細胞大規模培養技術:懸浮培養,微載體培養,多孔載體培養,微囊化培養,中空纖維法等.8. 器官培養的意義：器官培養的基本技術要點是取出動物器官或進一步修整成器官型植塊,將其接種到固體培養基上或培養液上,在適當的營養,氣相,生長基質等條件下使其存活和生長.迄今為止醫學界已經對乳腺,眼,內耳,肝,腦,角膜,腎,肺,骨,皮膚,子宮,胸腺,腸,牙.氣管,副甲狀腺,心臟,食管等人體器官進行培養,解決了醫學上的重大問題.9. 干細胞:

24、干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞.形態上通常呈圓形或橢圓形,體積小,核質比例大.具有較高的端粒酶活性,因此具有較強的增殖能力.干細胞培養的意義:1)組織培養或器官修復；2)基因治療10. 用于植物細胞大量培養的生物反應器：攪拌式反應器、氣聲式生物反應器、固定化細胞反應器光照反應器、轉鼓式生物反應器、空氣和細胞雙升式反應器。11. 組織工程：是應用細胞生物學和工程學原理，將人體某些部分的組織細胞種植和吸附在一種生物材料支架上進行人工培養、繁殖、擴增，然后移植到人體內所需要的部位，從而達到器官修復或再造的治療目的的一種技術。第十二章 動物細胞融合1. 動物細胞融合方法：仙臺病毒法,PEG誘

25、導融合,電融合技術.2. 動物細胞融合技術的用途：動物細胞融合最有價值的應用就是利用雜交瘤技術生產單克隆抗體.動物細胞融合技術步驟:1)動物免疫與免疫脾細胞懸浮液的制備；2)骨髓瘤細胞的獲得與培養；3)細胞融合；4)HAT選擇雜交瘤；5)抗體的檢測與雜交瘤的選擇；6)單克隆抗體的大量生產.第十三章 胚胎工程1. 胚胎工程：以體外受精和體外早期胚胎發育為基礎,在胚胎發育過程中進行的卵子切割,性別控制,嵌合體制作,細胞核移植,轉基因操作等定向控制,改造和創造新遺傳性狀的技術統稱胚胎工程.2. 對動物實施胚胎工程的意義：發揮優良母畜的繁殖能力；促進家畜改良的速度；作為胚胎操作的基礎；保存遺傳資源3.

26、 胚胎工程采用的技術:體外受精,胚胎移植,胚胎分割與融合,胚胎性別鑒定,胚胎冷凍,基因導入等. 核心技術:體外受精,胚胎移植.4. 胚胎移植:又稱受精卵移植,是指母畜發情排卵并經過配種后,從其生殖道取出受精卵和胚胎,或者體外培養受精卵發育到囊胚期,然后把它們移植到與供體同時發情排卵,但未經配種的母畜的輸卵管或子宮角,使來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床,并繼續生長和發育,最后產下供體的后代.即借腹懷胎.胚胎分割:主要是借助顯微操作技術或徒手操作方法,將一枚早期胚胎切割成2,4等多等分,再移植給受體動物,從而制造同卵雙生或多生后代的技術.胚胎融合:又稱胚胎嵌合,是將兩枚或兩枚以上同種或異種動物胚

27、胎的部分或全部細胞融合在一起,使之發育成一個胚胎,然后移植到受體內,讓其繼續發形成一種嵌合體后代的技術.性別控制：通過人為干預或操作手段，使動物按人們的愿望繁殖所需要的性別后代的技術。5. 胚胎移植過程：供體受體的選擇超數排卵處理同步發情人工受精胚胎的采集、鑒別胚胎移植6. 試管動物:將供體動物的精子和卵子在體外受精,體外培養胚胎,然后發育到一定程度的胚胎移植入受體,所獲得的動物成為試管動物.試管動物的培養過程:雌性供體超排卵處理,雄性供體人工受精-體外人工受精-采集受精卵-體外培養或冷凍保存-雌性受體選擇-胚胎移植-受體內發育-試管動物.7. 試管嬰兒:試管嬰兒是指分別將卵子和精子取出后,在體外進行受精,并發育成胚胎,再植回母體子