1、柱層析分離色素一、【實驗目的 】1 了解柱層析的分類，掌握各種柱層析的原理。2 熟練掌握吸附層析的原理和操作技術。二、【實驗原理 】葉綠體色素是植物吸收太陽光能進行光合作用的重要物質，主要有葉綠素a 、葉綠素 b、胡蘿卜素和葉黃素組成 。 從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對其認識和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機溶劑的特性 ，可用 95%乙醇或無水乙醇提取 。分離色素的方法有多種，如紙層析 、柱層析等 。 柱層析法是色譜法中的一種，它是根據混合物中各組分對固定相的吸附能力，以及對洗脫劑 （即移動相 ）的溶解度不同將各組分分離。常用的柱色譜有吸附色柱譜和分配柱色譜兩類。 吸附柱色譜通常是在

2、玻璃管中填入表面積很大，經過活化的多孔性物質或粉狀固體作為吸附劑（如氧化鋁或硅膠 ）， 當混合物的溶液流經吸附柱時，就被吸附在柱的上端，然后從柱頂加入溶劑（洗脫劑 ）洗脫 。 由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶劑中的溶解度也不同 ，因此各組分隨溶劑以不同速度下移，形成色帶 。 繼續用溶劑洗脫 ，吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先流出，整個層析過程進行反復的吸附- 解析 - 再吸附 - 再解吸 。用柱層析法可以分別收集各組分 ，并逐個鑒定 。本實驗是把三氧化二鋁填入玻璃管中（壓成柱狀 ）作為吸附劑 ，將葉綠體色素的石油醚提取液傾于吸附柱上 ，色素即被吸附 。 由于色素的種類不同 ，被吸

3、附的強弱不同 ，就在吸附柱上排列成為不同的色層 ，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力 ，用不同的溶劑進行洗脫 ，從而達到葉綠體主要的 4 種色素 （葉綠素 a 、葉綠素 b、葉黃素 、胡蘿卜素 ）的分離 。三 、【實驗材料 】原料 ：新鮮的菠菜葉試劑 ：1 無水乙醇或95%乙醇5.三氧化二鋁2 石英砂6飽和氯化鈉溶液3 丙酮7.水硫酸鈉4 石油醚 （ 60-90）8洗脫液 ：丙酮 ：石油醚 1： 9器材 ：層析柱 （ 1× 30cm），研缽 ，蒸餾裝置 ，脫脂棉 ，天平 ，燒杯 ，過濾漏斗 ，玻璃棒 ， 錐形瓶 ，分液漏斗 ， 試管 ，鐵架臺四、【實驗操作 】1 色素的提取 ：2

4、0 克菠菜 ，加少許石英砂 ，再加 20 毫升無水乙醇研磨成漿 ，脫脂棉過濾 ，保存濾液 ，濾渣再用無水乙醇提取一次 ，合并濾液 ，濾渣再加入 30 毫升石油醚提取一次 ，過濾，合并濾液 ，轉移至分液漏斗中 , 再加入 40 毫升飽和氯化鈉溶液震蕩 ，棄去下層溶液 ，再分別加入 20 毫升水震蕩洗滌幾次 ，直至下層無色 ，保留上層溶液 ，轉移至三角瓶中，加入無水硫酸鈉干燥5 分鐘 ，備用 .2 樣品的濃縮 ：將提取液放入蒸餾燒瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液體5-8毫升左右 ，以備加樣使用。3 層析拄的制備：15 克堿性三氧化二鋁加入30 毫升石油醚攪拌，浸泡 10min.。在層析拄內加入一團

5、棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上 ，然后用石油醚半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內，倒時應該緩慢，重復使用下面的石油醚，直到裝完 。 用石油醚洗柱內壁，頂部加一小團棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高 。3 樣品的分離層析：吸附層析分離色素打開層析拄下部開關，向拄內加入2 毫升濃縮液 ，至液體沒入砂內，再加入石油醚沖洗拄壁，液體浸入砂內，加洗脫液開始層析，可以看到不同色帶如圖片1 ，直至第一條色帶洗脫完畢，在拄下面用試管接收第一條色帶的洗脫液，如圖片 2 。五、【實驗結果 】實驗結果如下圖：圖一 ：層析柱中出現黃色帶圖二 ：提取出的黃色胡蘿卜素結果分析 ：洗脫過程中 ，首先有一條黃

6、色的色帶圈沿著層析柱下移，色帶圈的各個方向的移動速度并不是完全相同 ，原因在于層析柱的制作過程并不完全均一，使層析柱內部不均勻，以至于色帶各方向的移動速度不同 。 最后收集得到亮黃色的胡蘿卜素。七、【注意事項 】1 、萃取時不要劇烈振蕩，以防止發生乳化現象。2 、為了保持柱子的均一性，使整個吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否則當柱中溶劑或溶液流干時 ，就會使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整個裝樣過程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。3 、在吸附劑上端加入脫脂棉（或濾紙 ）是使加樣品時不致把吸附劑沖起；在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子 ）可以防止吸附劑細粒流出。4 、層析柱填裝緊密與否，

7、對分離效果很有影響，若各部分松緊不勻，會影響滲透速度和顯色的均勻 。6 、洗脫流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠，色素分離不開 ；也不要過慢 ，使柱裝得太松 ，導致層析過程中 ，凝膠床高度下降，色素洗脫很慢 。 因此應控制洗脫流速，以每分鐘6080滴為宜 。7 、樣品一定要足夠濃縮，加樣量不要過大，過大，分離條帶過寬，如果層析拄不夠長，各組分不易分開 ，易同時洗脫下來；加樣量過少 ，色帶不是很清楚，不易觀察 ，效果不好 。8 、層析柱粗細必須均勻，柱管大小可根據試劑需要選擇。一般來說 ，細長的柱分離效果較好。若樣品量多 ，最好選用內徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內徑太小時，會發生 “管壁效應

8、 ”，即柱管中心部分的組份移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長 ，分離效果越好 ，但柱過長 ，實驗時間長，樣品稀釋度大 ，分離效果反而不好。八、【實驗小結 】在該柱層析分離色素實驗中，我了解了柱層析技術的相應方法和原理，學會了層析柱的制作和準備，進一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質、洗脫液的配比、層析柱的制作及洗脫液的流速是本實驗成功與否的三大關鍵因素。知識拓展 ：1 、溶劑的選擇 ：（ 1 ）吸附劑要求較純 ，否則會影響樣品的吸附和洗脫 。（ 2 ）溶劑和吸附劑不能起化學反應 。（ 3 ）溶劑的極性應比樣品小 ，如果大了 ，樣品不宜被吸附劑吸附 。（ 4 ）溶劑對樣品的溶解度不能太大

9、 ，否則影響吸附 ，但也不能太小 ，溶液的體積增加 ，易使色譜分散 。（ 5 ）可使用混合溶劑 ，如有的組分含有較多的極性基團，在極性小的溶劑中溶解度太小 。 也可選用極性大的溶劑溶解，然后加入一定量的非極性溶劑。這樣既降低了極性，又減少了溶液的體積。2 、洗脫劑的選擇：樣品吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑。如果原來用于溶解樣品的溶劑沖洗柱不能達到分離的目的，可以改用其他溶劑，一般極性較強的溶劑影響樣品和氧化鋁之間的吸附 ，容易將樣品洗脫下來，達不到分離的目的。因此常用一系列極性漸次增強的溶劑，既先使用極性最弱的溶劑，然后加入不同比例的極性溶劑配成洗脫溶劑。常用的洗

10、脫溶劑的極性按如下次序遞增。己烷和石油醚 環己烷 四氯化碳 三氯乙烯二硫化碳 甲苯二氯甲烷 氯仿乙醚乙酸乙酯 丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。 篇二：實驗六 ：薄層層析與柱層析實驗六薄層層析與柱層析實驗目的1. 了解偶氮苯的光學異構反應 ，加深對光化學反應的理解 。2. 掌握薄層層析的基本操作 , 薄層層析分離順 、反式偶氮苯 。3. 了解柱層析分離有機化合物的原理，初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作方法4. 采用柱層析分離反式偶氮苯與靛紅的混合物實驗原理偶氮苯是最簡單的芳香偶氮化合物，眾多偶氮染料的母體結構。含有兩個苯基分別與偶氮基n=n 兩端相連的結構 。 偶氮苯有毒 ，易燃 。 偶氮苯有順 （

11、z ） - 反（ e ） - 異構體 。 反式為橙紅色棱形晶體，蒸氣為深紅色 ，溶于乙醇 、乙醚 、醋酸和水 。 反式的熱力學性質穩定 。當溶于乙醇的偶氮苯用一定強度的紫外光照射時，順式的比例逐漸增大，直至達到平衡，形成順反異構體的混合物。偶氮苯的光致異構是很多偶氮類功能材料光響應的基礎。順式為橙紅色片狀晶體，不穩定 ，在加熱或可見光照射下能夠變成反式。色譜方法是通過在固定相和流動相間分配的不同而將物質分離開。待分離混合物各組分在固定相上的吸附強度不同，與流動相一起移動的速度也不同，因此被分離開 。薄層色譜屬于固- 液吸附色譜 。薄層色譜板中的固定相中的微孔結構使得溶劑在毛細管作用下能夠沿著色

12、譜板向上移動。由于混合物中各組分對吸附劑（固定相 ）的吸附能力不同，當展開劑 （流動相）流經吸附劑時發生無數次吸附解附過程，吸附力弱的組分隨流動相迅速向前移動，吸附力強的組分滯留在后 ，由于各組分具有不同的移動速度，最終在固定相薄層析上分離。 tlc除了用于分離外，還可以通過與已知結構的的化合物比對，鑒定少量有機混合物的組成，它也是柱色譜尋求最佳展開劑的手段。上圖中紅色化合物的rf等于豎直紅線的長度除以豎直藍線的長度。柱層析也屬于固- 液吸附色譜 。在一根玻璃 “分離柱 ”中進行 。 管中裝上適當的粉末作為國定相。待分離或純化物質的溶液（流動相 ）在重力作用下流經吸附劑時，不同物質對溶劑和吸附

13、劑的親和力不同 ，因而被吸附的程度不同，從而以不同速度流動，使化合物得以分離。靛紅與偶氮苯在極性上具有較大差異 ，從而可以使用極性適中的展開劑，通過柱層析將二者分離。儀器與試劑分析天平 ， tlc，錐形瓶 ，毛細管 ，層析柱 ，棉花，量筒 ，硅膠，蒸發皿 ，展缸 ；etoac,ch2cl2,石油醚 ，靛紅 ；請自帶尺子 （用于計算 rf值）顏老師在實驗開始之前已經準備好的試劑：a.偶氮苯的溶液 （ 15 mg in 1ml etoh）； b. 靛紅的溶液 （ 15 mg in 1ml ch2cl2）； c.靛紅與偶氮苯的均勻混合物（靛紅 1.4 g +偶氮苯3.5 g）。實驗內容a) 光照異構

14、化取 0.1 g反式偶氮苯溶于5 ml無水乙醇中 ，將此溶液放于試管中，密封 ，置于可見光下二星期，以便與光照前的溶液進行對比。b)薄層層析取管口平整的毛細管吸取光照后的偶氮苯溶液，在離薄層板邊沿約0.5 cm的起點線上點樣。再用另一毛細管吸取未經光照的反式偶氮苯溶液點樣。待乙醇揮發后 ，將點好樣品的薄層板放入內襯濾紙的展缸中 。 展缸內已放置展開劑（乙酸乙酯 / 石油醚 =1/40）。 薄層板的點樣端在下方，浸入展開劑 ，展開劑不要沒過起點線，也不要碰到樣品點。待展開劑前沿上升到離板的上端約1 cm處時 ，取出薄層板 ，立即用鉛筆在展開劑上升的前沿處劃一記號，置于空氣中晾干。可觀察到薄層板上

15、經光照后的偶氮苯溶液點樣處上端有兩個黃色斑點（哪一個斑點是順式的？哪一個斑點是反式的？） 。計算異構體的rf值。用上述相同的方法與偶氮苯的混合物進行c) 柱層析，采用 ethyl acetate : petroleum ether = 1:1為展開劑 ，對靛紅tlc，為下面的柱層析選擇展開劑。1將層析柱固定在鐵架臺上，一定要保持柱子豎直 。2將層析柱洗凈后在柱底部放入一小團脫脂棉花。3 在錐形瓶中稱重 7g 硅膠 （ sio2 ）， 并用 ethyl acetate : petroleum ether(1:40) 調勻 。 在層析柱的下方放置一個錐形瓶，以收集流下的液體 。 加入少量洗脫劑于層

16、析柱中 ，以潤濕棉花 ，使其貼在柱子下端 。4打開層析柱活塞 ，控制溶劑下流 ，將硅膠懸濁液沿柱子側壁加入，并用少量的溶劑洗去殘余的硅膠，并加入柱中 。用裝有橡皮管或塞子由下向上輕輕敲擊柱子外壁 ，將氣泡趕出 ，使硅膠填裝均勻 。 并加壓使硅膠緊密，以獲得較好的分離效果。輕輕敲擊 ，使硅膠最上層成均勻平面，然后用藥匙沿柱子側壁，輕輕地 、慢慢地在硅膠表面覆蓋一層海砂（注意 ：不要破壞硅膠的上平面）。關閉活塞 ，備用。5 打開活塞 ，當溶劑液面降至海砂表面時，關閉活塞 。 用滴管沿柱子側壁加入靛紅與偶氮苯混合物的溶液（稱取 40 mg ，置于 1.5ml的塑料樣品管，加入 1 ml二氯甲烷 （

17、ch2cl2），超聲振蕩使其溶解）。 打開活塞 ，使溶劑液面降至海砂表面，關閉活塞 。 再用少量的展開劑洗塑料樣品管，加入層析譜中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴 ，打開活塞 ，流到液面 ，關閉活塞 。 重復上述操作 ，直到將所有化合物沖到硅膠里面 。6 沿側壁加入大量的洗脫劑ethyl acetate : petroleum ether (1:40)，打開活塞，加壓保持一定的流速，觀察色帶的形成和分離。7 當第一個有色帶到達柱底時，并且沒有流出之前，關閉活塞 ，倒空錐形瓶，打開活塞 ，收集全部色帶。然后，改用 ethyl acetate : petroleum ether (1:1)作為洗脫劑

18、 。 關閉活塞 ，換一個空的且干凈的錐形瓶，打開活塞 。當第二個有色帶到達柱底時，并且沒有流出之前，關閉活塞 ，倒空錐形瓶，打開活塞 ，收集全部色帶。柱層析分離結束。8 柱層析分離結束后，采用 tlc對上述分離的兩個溶液進行分析，總結分離效果 。 同時 ，打開層析柱活塞，在加壓下讓展開劑流干，然后將硅膠倒入指定的固體廢物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。預習時的問題1. 在薄層層析實驗中 ，為什么點樣的樣品斑點不可浸入展開劑的溶液中 ？為什么進行薄層層析時展缸要蓋上蓋 ？2. 當用混合物進行薄層層析時 ，如何判斷各組分的在薄層板上的位置 ？靛紅與偶氮苯 ，哪一個的極性較強 ？為什么 ？3.柱層析

19、時柱中若留有空氣或者是填裝不均勻，對分離效果有何影響？如何避免 ？4. 偶氮苯和靛紅物理化學性質 ？毒性？有什么應用 ？偶氮苯光照異構化的機理 ？ why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它閱讀材料1. 光化學由光的作用引起的化學反應近年來日益受到人們的重視，光合作用就是最重要的光化學反應。研究激發態分子化學行為的光化學反應已經成為有機化學的一個重要分支。光不僅可以引起多種多樣的化學反應 ，合成各種前所未有的奇妙反應分子，而且與我們的日常生活及生命現象有著密切的聯系。2.薄層色譜1.固定相的選擇氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜

20、常用的固定相。氧化鋁多用于分離堿性或中性有機物；而硅膠的吸si-oh薄層色譜用的硅膠有薄層色譜用的硅膠有60g 、 6ogf254、 60h 、 60hf254和 60hf254+366等類型 ，其中 g 表示含有13 硫酸鈣 （作為黏合劑 ）； h 表示不含硫酸鈣； f254表示含有2 無機熒光物質 ，在 254 nm的紫外光照射下發出綠色熒光。與硅膠相似 ，氧化鋁也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁h 、氧化鋁g 、氧化鋁 hf254和氧化鋁 gf254等類型 。 黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉 、羧甲基纖維素（ cmc) 。2. 操作方法點樣在薄層板一端約1cm 處，用鉛筆輕輕劃一條作為起點

21、線。樣品用易揮發性溶劑溶解后，用毛細管吸取樣品溶液，輕輕接觸到起點線的某一位置上。如果溶液太稀 ，可多點幾次 ，但要等第一次樣品溶劑揮發后 ，再點第二次 。點好樣品后 ，待溶劑揮發干凈，才可以進行下面的展開過程。展開劑的選擇選擇展開劑 ，首先應考慮對被分離物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅膠和氧化鋁都是極性吸附劑 ，所以展開劑的極性越大，試樣在薄板上移動的距離越遠， rf值（ rf值是一個化合物在薄層板上上升的高度與展開劑上升的高度的比值）越大 。 例如，在分離過程中常發現rf太小，說明展開劑極性不夠，需要考慮加入一種極性強的展開劑進行調控。 發現 rf值太小 ，說明展開劑極性不夠，需要考慮加

22、入一種極性強的展開劑進行調控。常用展開劑的洗脫力由小到大的順序為：石油醚 、環己烷 、四氯化碳 、二氯甲烷 、氯仿 、乙醚、四氫呋喃 、乙酸乙醋 、丙酮、正丁醇 、乙醇 、甲醇 、水、冰乙酸 、吡啶 、有機酸等 。此外 ，在展開過程中，展開缸內展開劑的蒸氣須始終處于飽和狀態。一般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上 （下端浸于展開劑中）， 蓋好密封一段時間。取放薄層板應迅速。顯色篇三 ：柱層析知識總結柱層析知識總結小木蟲 ( 金幣 +1):獎勵一下 ，鼓勵發有價值的話題xiazanwen(金幣 +5):辛苦了 2010-08-24 06:34:58楓葉子 2006:編輯內容2010-10-24 17:1

23、0柱層析利用層析柱將混合物各組分分離開來的操作過程稱為柱層析 。 柱層析是層析技術中的一類其作用原理又可分為吸附柱層析 、分配柱層和離子交換柱層析等 。 其中以吸附柱層析應用最廣只介紹吸附柱層析的相關問題 ，其操作方法也可作為其他類型柱層析的參考 。，依據。以下1.吸附柱層析的器材(1)層析柱實驗室中所用的玻璃層析柱有兩種形式 ：一是下部帶有活塞的玻璃管 ，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的 ，這樣可以不涂真空油脂 ，以免污染產品 。 如果使用普通的玻璃活塞 ，則真空油脂要小心地涂薄涂勻 。 另一種是將玻璃管下端拉細 ，套上一段彈性良好的管子 。 這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的 ，普通橡皮管一般

24、不可充作此用 ，因為橡皮易被氯仿 、苯、 thf 等溶劑溶脹 ，而聚乙烯管子對大多數溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，此外 ，薄膜塑料柱因使用方便、節省淋洗劑 、減少蒸發量等優點 ，應用日趨廣泛 。 薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的 ，兩側常有很深的折痕使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊 ，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊 。 將這段玻璃管穿過一個單孔塞 。 然后將薄膜管放進一根又粗又長 ，下端拉細了的玻璃管內 ，使塞子塞緊大玻璃管的口 。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內部壓強大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個小孔即可使用。層析柱的尺寸根據被分離物的量來確定

25、，其直徑與高度之比則根據被分離混合物的分離難易而定，一般在1 8 到 1 50 之間 。 柱身細長 ，分離效果好 ，但可分離的量小，且分離所需時間長；柱身短粗 ，分離效果較差，但一次可以分離較多的樣品，且所需時間短。如果待分離物各組分較難分離，宜選用細長的柱子 ，如果要處理大量的較易分離的或對分離純度要求較低的混合物，則可選用粗而短的柱子。最常使用的層析柱，直徑與長度之比在1 8到 1 15之間。(2)吸附劑柱層析中最常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。 其用量為被分離樣品的30 50 倍，對于難以分離的混合物 ，吸附劑的用量可達100 倍或更高 。 對于吸附劑應綜合考慮其種類、酸堿性 、粒度及活性

26、等因素 ，最后用實驗方法選擇和確定。市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后 ，用蒸餾水洗到其浸出液的 ph 值為 4 ，適用于分離酸性物質 ；堿性氧化鋁浸出液的 ph 值為 9 10 ，用以分離胺類 、生物堿及其他有機堿性化合物 。 中性氧化鋁的相應 ph 值為 7.5 ，適合于醛 、酮、醌、酯等類化合物的分離以及對酸 、堿敏感的其他類型化合物的分離。硅膠沒有酸堿性之分，可適用于各類有機物的分離。柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100 150 目，硅膠為 60 100 目，如果顆粒太小 ，淋洗劑在其中流動太慢，甚至流不出來。氧化鋁和硅膠的活性各分五個等級。哪個活性級別分離效

27、果最好，要用實驗方法確定，而不是盲目選擇高的活性級別，最常使用的是 級。 如果吸附劑活性太低，分離效果不好，可通過 “活化 ”來提高其活性 。 所謂 “活化 ”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分 ，提高其吸附活性的過程 。通常是將吸附劑裝在瓷盤里放進烘箱中恒溫加熱 。“活化 ”的溫度和時間應根據分離需要而定 。 氧化鋁一般在 200 恒溫 4h ，硅膠在 105 110 恒溫 0.5 1h 。 “活化 ”完畢 ，切斷電源 ，待溫度降至接近室溫時，從烘箱中取出放進干燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些。此外 ，一些天然產

28、物帶有多種官能團，對微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素、淀粉或糖類作吸附劑 。 活性碳是一種吸附能力很高的吸附劑，但因粒度太小而不常用。(3)淋洗劑淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡稱溶劑。其極性大小和對被分離物各組分的溶解度大小對于分離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強烈吸附，從而將原來被吸附的待分離物“頂替 ”下來 ，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠小于各組分的極性，則各組分被吸附劑強烈吸附而留在固定相中 ，不能隨流動相向下移動，也不能達到分離的目的。如果淋洗劑對于被分離物各組分溶解度太大 ，

29、被分離物將會過多、過快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會造成譜帶分散，甚至完全不能分開。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同，很多資料給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，首先在薄層層析板上試選，初步確定后再上柱分離。如果所有色帶都行進甚慢則應改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑，直至獲得滿意的分離效果。除了分離效果外還應當考慮：在常溫至沸點的溫度范圍內可與被分離物長期共存不發生任何化學反應 ，也不被吸附劑或被分離物催化而發生自身的化學反應；沸點較低以利回收；毒性較小 ，操作安全

30、 ；適當考慮價格是否合算，來源是否方便 ；回收溶劑一般不應作為最終純化產物的淋洗劑。淋洗劑的用量往往較大，故最好使用單一溶劑以利回收。只有在選不出合適的單一溶劑時才使用混合溶劑 。 混合溶劑一般由兩種可以無限混溶的溶劑組成，先以不同的配比在薄層板上試驗，選出最佳配比 ，再按該比例配制好，像單一溶劑一樣使用。如果必須在層析過程中改變淋洗劑的極性，不能把一種溶劑迅速換成另一種溶劑，而應當將極性稍大的溶劑按一定的百分率逐漸加到正在使用的溶劑中去 ，逐步提高其比例 ，直至所需要的配比 。一條經驗規律稱為“冪指數增加 ”，例如 ，原淋洗劑為環己烷 ，如欲加入二氯甲烷以增加其極性，則不應立即換為二氯甲烷，

31、而應使用這兩種溶劑的混合液，其中二氯甲烷的比例依次為5%， 15%， 45%，最后再換為純凈的二氯甲烷。每次加大比例后 ，須待流出液量為吸附劑裝載體積的3 倍時再進一步加大比例 。 這只是一般方法 ，其目的在于避免后面的色帶行進過快 ，追上前面的色帶 ，造成交叉帶 。 但如果兩色帶間有很寬闊的空白帶，不會造成交叉 ，則亦可直接換成后一種溶劑 ，所以應根據具體情況靈活運用。(4) 被分離的混合物在實際工作中 ，被分離的樣品是不能選擇的，但認真考察各個組分的分子結構，估計其吸附能力 ，對于正確選擇吸附劑和淋洗劑都是有益的。若化合物的極性較大，或含有極性較大的基團，則易被吸附而較難被洗脫 ，宜選用吸

32、附力較弱的吸附劑和極性較大的淋洗劑。反之 ，對于極性較小的樣品則選用極性較強的吸附劑和弱極性或非極性淋洗劑。若各組分極性差別較大，則易于分離 ，可選用較為短粗的柱子 ，使用較少的吸附劑 ；若各組分極性相差甚微 ，則難于分離 ，宜選用細長的柱子并使用較大量的吸附劑 。(5) 其他物品儲存淋洗劑的分液漏斗一只，接收洗出液的錐形瓶若干只，其容積大小根據淋洗劑的體積確定。玻璃毛少量 ，白沙少量 ，各自洗凈烘干。若層析柱很小，也可用少量脫脂棉代替玻璃毛。2. 吸附柱層析的操作(1) 裝柱裝柱的方法分濕法和干法兩種 。濕法裝柱時 ，將柱豎直固定在鐵支架上 ，關閉活塞 ，加入選定的淋洗劑至柱容積的1/4，用

33、一支干凈的玻璃棒將少量玻璃毛( 或脫脂棉 ) 輕輕推入柱底狹窄部位 ，小心擠出其中的氣泡，但不要壓得太緊密 ，否則淋洗劑將流出太慢或根本流不出來。將準備好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均勻沉積成約 5mm 厚的一層 。 將需要量的吸附劑置燒杯中，加淋洗劑浸潤 ，溶脹并調成糊狀 。 打開柱下活塞調節流出速度為每秒鐘 1 滴，將調好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩注入柱中，同時用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身 ，使吸附劑在淋洗劑中均勻沉降，形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑最好一次加完 。若分數次加 ，則會沉積為數層 ，各層交接處的吸附劑顆粒甚細，在分離時易被誤認為是一個色層。全部吸附劑加完后 ，在吸附劑沉積

34、面上蓋一層白沙( 如柱很小 ，也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內徑相當的濾紙片 ) ，關閉活塞 。 在全部裝柱過程及裝完柱后，都需始終保持吸附劑上面有一段液柱，否則將會有空氣進入吸附劑 ，在其中形成氣泡而影響分離效果。 如果發現柱中已經形成了氣泡，應設法排除 ，若不能排除 ，則應倒出重裝 。 裝好的吸附柱各層材料的分布見圖3-36 。干法裝柱時 ，先將柱豎直固定在鐵支架上，關閉活塞 。 加入溶劑至柱容積的 3/4，打開活塞控制溶劑流速為 1 滴 / 秒，然后將所需量的吸附劑通過一支短頸玻璃漏斗慢慢加入柱中，同時 ，輕輕敲柱身使柱填充緊密 。干法裝柱的缺點是容易使柱中混有氣泡。特別是使用硅膠為吸附

35、劑時，最好不用干法裝柱 ，因為硅膠在溶劑中有一溶脹過程，若采用干法裝柱，硅膠會在柱中溶脹，往往留下縫隙和氣泡，影響分離效果 ，甚至需要重新裝柱 。裝填薄膜塑料柱時 ，可先用抽氣法將薄膜展開成圓柱形，在底部裝入一段玻璃毛，吸附劑通過一個粗頸漏斗自柱頂裝入 。裝至 1/3 處，將柱身在堅硬的表面上礅結實，再裝入 1/3 ，再礅結實 ，直至裝到需要的高度。裝成的薄膜柱應緊密結實，可以像玻璃柱那樣用夾子夾住，再在其底部扎一些小孔即可使用。 (2)加樣加樣亦有干法 、濕法兩種 。 濕法加樣是將待分離物溶于盡可能少的溶劑中，如有不溶性雜質應當濾去 。打開柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處，關閉活

36、塞 ，將配好的溶液沿著柱內壁緩緩加入 ，切記勿沖動吸附劑，否則將造成吸附劑表面不平而影響分離效果。溶液加完后 ，小心開啟柱下活塞 ，放出液體至溶液液面降至濾紙片時，關閉活塞 ，用少許溶劑沖洗柱內壁 ( 同樣不可沖動吸附劑 ) ，再放出液體至液面降到濾紙處，再次沖洗柱內壁 ，直至柱壁和柱頂溶劑沒有顏色。加樣操作的關鍵是要避免樣品溶液被沖稀。在技術熟練的情況下 ，也可以不關下部活塞，在每秒鐘1 滴的恒定流速下連貫地完成上述操作 。干法加樣是將待分離樣品加少量低沸點溶劑溶解，再加入約 5 倍量吸附劑 ，拌和均勻后在通風櫥中蒸發至干 。 揭去柱頂濾紙片 ，將吸附了樣品的吸附劑平攤在柱內吸附劑的頂端，在

37、上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙 。 干法加樣易于掌握，不會造成樣品溶液的沖稀，但不適合對熱敏感的化合物 。(3) 淋洗和接收樣品加入后即可用大量淋洗劑淋洗。隨著流動相向下移動，混合物逐漸分成若干個不同的色帶，繼續淋洗 ，各色帶間距離拉開 ，最終被一個個淋洗下來。當第一色帶開始流出時，更換接收瓶 ，接收完畢再更換接受瓶 ，接受兩色帶間的空白帶，并依此法分別接收各個色帶。若后面的色帶下行太慢，可依次使用幾種極性逐漸增大的淋洗劑來淋洗。為了減少添加淋洗劑的次數，可用分液漏斗在柱頂“自動 ”添加。 分液漏斗的活塞打開，頂塞密封 ，尾部插進柱上部的淋洗劑液面以下，當液面下降后 ，漏斗尾部露出 ，即有空氣泡

38、自尾部進入分液漏斗，這就加大了漏斗內液面上的壓力，漏斗內的淋洗劑就自動流入柱內 ，使柱內液面上升 ，當液面淹沒漏斗尾部時，就不再有空氣進入漏斗，漏斗內的淋洗劑就不再流出 。 在使用薄膜塑料柱進行層析時，一旦色帶形成并拉開距離，可將柱吸干 ，用刀沿 “空白帶 ”處切開 ，將各色帶分別萃取 ，各自蒸去溶劑 ，即得到相應組分的化合物。(4) 顯色分離無色物質時需要顯色。如果使用帶螢光的吸附劑，可在黑暗的環境中用紫外光照射以顯出各色帶的位置 ，以便按色帶分別接收。但柱上顯色遠不如在薄層板上顯色方便。所以常用的辦法是等分接收 ，即事先準備十幾個甚至幾十個接收瓶，依次編出號碼，各接收相同體積的流出液，并各

39、自在薄層板上點樣展開，然后在薄層板上顯色( 相關的顯色操作見薄層層析部分) 。具有相同r 值的為同一組分 ，可以合并處理。也可能出現交叉帶，若交叉帶很少，可以棄之 ，若交叉帶較多，或樣品很貴重，可以將交叉部分再次作柱層析分離，直至完全分開。3. 柱層析操作中應注意的問題(1) 要控制淋洗劑流出的速度 。一般控制流速為 1 滴 / 秒 。 若流速太快 ，樣品在柱中的吸附和溶解過程來不及達到平衡 ，影響分離效果 。 若流速太慢 ，分離時間會拖得太長 。 有時 ，樣品在柱中停留時間過長 ，可能促成某些成分發生變化 。 或流動相在柱中下行速度小于樣品的擴散速度 ，會造成色帶加寬 、交合甚至根本不能分離

40、 。(2) 以下現象會嚴重影響分離效果 ，必須盡力避免 。a.色帶過寬 ，界限不清 。造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當，或吸附劑 、淋洗劑選擇不當 ，或樣品在柱中停留時間過長。但更常見的卻是在加樣時造成的。若在樣品溶液加進柱中后 ，沒有打開下部活塞放出淋洗劑使樣品溶液降至濾紙片處，即急于加溶劑沖洗柱壁，造成樣品溶液大幅度稀釋，或過早加大量溶劑淋洗，必然會造成色帶過寬。所以溶樣時一定要使用盡可能少的溶劑，加樣時一定要避免樣品溶液的稀釋。b.色帶傾斜 。 正常情況下柱中的色帶應是水平的，而傾斜的色帶 ，在前一個色帶尚未完全流出時，后面色帶的前沿已開始流出，所以不能接收到純粹的單一組分。造成

41、色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜，或柱身安裝得不垂直。c.氣泡。 造成氣泡的原因可能是玻璃毛或脫脂棉中的空氣未擠凈，其后升入吸附劑中形成氣泡，也可能是吸附劑未充分浸潤溶脹，在柱中與淋洗劑作用發熱而形成，但更大量的是在裝柱或淋洗過程中淋洗劑放出過快，液面下降到吸附劑沉積面之下，使空氣進入吸附劑內部滯留而成。當柱內有氣泡時 ，大量淋洗劑順氣泡外壁流下，在氣泡下方形成溝流，使后一色帶前沿的一部分突出伸入前一色帶，從而使兩色帶難于分離。所以在裝柱及淋洗過程中應始終保持吸附劑上面有一段液柱。d.柱頂面填裝不平 。 這時色帶前沿將沿低凹處向下延伸進入前面的色帶，這也是一種溝流 。e. 斷層和裂縫 。當

42、柱內某一區域內積有較多氣泡時 ，這些氣泡會合并起來在柱內形成斷層或裂縫。裂縫造成的溝流 ，而斷層相當于一個不平整的裝載面 。1 語源學 2 類別 3 基本原理4 幾種常用的層析語源學chrome意為 “色彩 ”， graphychromatography譯來的 。源自希臘文 ，意為 “寫 ”。 色譜為層析的同義語，都是從英語層析 （色譜 ） chromatograpby在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體 （與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分

43、離開的定性與定量分析方法，稱為層析 ，亦稱色譜法 。 根據移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭 、氧化鋁 、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體 ，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（ column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（ thin-layer chromatography）， 篇四：凝膠層析試驗報告摘要凝膠色譜技術是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分技術，由于設備簡單、操作方便，不需要

44、有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（ gfc ）和凝膠滲透色譜（ gpc ） 。 gfc一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。本實驗用凝膠色譜法對食用油中的甘油三酯進行了分離提取。關鍵詞 ：凝膠色譜甘油三酯食用油第一章簡介凝膠層析法凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等 。 它的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷 ，吸附力弱 ，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。一、凝膠的選擇根

45、據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由于它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用sephadex g-25和 g-50 ，對于小肽和低分子量的物質（ 1000-5000）的脫鹽可使用sephadex g-10， g-15及 bio-gel-p-2或 4 。 如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。 一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由于 kd 不同，最后得到分離 。二、柱的直徑與長度根據經驗 ，組別分離時 ，大多采用2-30

46、cm長的層析柱 ，分級分離時 ，一般需要100cm 左右長的層析柱 ，其直徑在1-5cm范圍內 ，小于 1cm 產生管壁效應，大于 5cm 則稀釋現象嚴重。長度 l與直徑 d 的比值 l/d一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間 。三、凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸， 1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。凝膠的裝填 ：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝

47、置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置 ，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面 。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無 “紋路 ”或氣泡 ，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄 、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲 、散亂、變寬時必須重新裝柱。四、加樣和洗脫凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體

48、積不大于凝膠總床體積的5 -10 。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質 ，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速 ，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定 。五、凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02的疊氮鈉 ，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免

49、干擾洗脫液的測定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用 70 、 90 、95 乙醇脫水平衡至乙醇濃度達 90 以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇 、濾干 、干燥保存 。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性 ，密封后高壓滅菌保存 。六、凝膠層析的應用1. 脫鹽：高分子 （如蛋白質 、核酸、多糖等 ）溶液中的低分子量雜質 ，可以用凝膠層析法除去 ，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速 、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為sephadexg-10、15 、 25 或 bio-gel-p-2、 4、 6。 柱長與直徑之比為5-15 ，樣品體積可達柱床體積的25 -30 ， 為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上 ，一般用醋酸銨等揮發性鹽類