1、【標(biāo)題】槲皮素的提取及分析測定研究進(jìn)展 【作者】劉劍波 【關(guān)鍵詞】槲皮素  提取方法  測定方法 【指導(dǎo)老師】賀 薇 【專業(yè)】化學(xué) 【正文】1引言槲皮素(QCT，quercet in)是一種具有多種生物活性黃酮類化合物具有很高藥用價(jià)值。在植物界中約有100種中草藥含有槲皮素，廣泛分布于多種植物花、果實(shí)、葉中，如中藥槐米干燥花蕾、地耳草(田基黃)、銀杏葉、番石榴葉、貫葉連翹、菟絲子、洋蔥、槐花、地錦草、刺五加、滿山紅等。其中在有些草藥中槲皮素含量很高，如槐花米中含量高達(dá)4 %左右，而且提取的方法也比較簡便，如乙醇回流提取法，微波輔助提取法，堿溶酸

2、水解法等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有多種藥理活性，且槲皮素毒副作用小, 越來越顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。90年代以來，有關(guān)槲皮素的抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗氧自由基、擴(kuò)血管等作用的研究取得了可喜的進(jìn)展。特別是槲皮素對腫瘤的化學(xué)預(yù)防作用和治療作用日益受到人們的重視。正因?yàn)殚纹に氐膹V泛的藥用價(jià)值，成為近年來國內(nèi)外醫(yī)藥界研究的熱門課題。因此從植物中提取出高含量、高純度槲皮素取以及研究槲皮素的含量測定方法具有廣泛的應(yīng)用前景。通過查閱文獻(xiàn)，到目前為止，槲皮素含量測定的方法主要有分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法、極譜法以及相繼出現(xiàn)的聯(lián)用技術(shù)等。但這些方法比較分散，沒有系統(tǒng)的進(jìn)行整

3、理，因此本文針對槲皮素的提取和測定進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，希望對研究槲皮素新的提取和含量測定方法提供一定的理論依據(jù)。2槲皮素簡介槲皮素(QCT，Quercetin)又名櫟精，槲皮黃素，是植物界分布廣泛，具有多種生物活性的黃酮類化合物。化學(xué)命名為 3,3,4,5 ,7-五羥基黃酮，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，其二水合物為黃色針狀結(jié)晶，溶于乙醇，堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水。因此在分析測定時(shí)需要加入部分乙醇或堿液促使其溶解。槲皮素主要來源于殼斗科植物伊比利亞櫟皮和葉，小檗科植物紅角蓮，金絲桃科植物紅旱蓮、金草，夾竹桃科植物紅麻等，同時(shí)許多中草藥如槐米、側(cè)柏葉、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、銀杏等均含有槲

4、皮素，尤其以銀杏科植物銀杏葉中含量豐富，在槐花米中含量高達(dá)4%左右。在這些植物中槲皮素多以甙的形式存在，經(jīng)酸水解可得到槲皮素。 圖2.1槲皮素結(jié)構(gòu)3槲皮素提取及測定方法3.1槲皮素的提取方法在天然產(chǎn)物中槲皮素的提取方法很簡單，如乙醇回流提取法，微波輔助提取法，超聲波輔助提取法，堿溶酸水解法等。下面就這些方法做一下簡單介紹。3.1.1乙醇回流提取法雍國新1采用回流提取法，利用乙醇提取荷葉中的槲皮素，通過4因素3水平正交試驗(yàn)，確定乙醇提取荷葉中槲皮素的最佳條件：最優(yōu)提取工藝為提取溫度100，乙醇溶液濃度為60%，固液比120，提取時(shí)間1h。在此條件下，槲皮素的轉(zhuǎn)移率在70.0%以上。3.

5、1.2微波輔助提取法微波加熱是透入內(nèi)部的能量被物料吸收置換成熱能對物料的加熱，形成獨(dú)特的物料受熱方式，具有均勻性的特點(diǎn)，同時(shí)具有反應(yīng)高效性和強(qiáng)選擇性等特點(diǎn)，而且操作簡便，副產(chǎn)物少，提取率高及產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)。本法多用在藥材的浸出，在槲皮素的提取上，取得了良好的效果。陳代武等2人對微波法提取絞股藍(lán)中的槲皮素進(jìn)行了研究，將絞股藍(lán)晾干、粉碎過篩，精確稱取粒度為160250m，水分含量為15%的絞股藍(lán)10g，加乙醇50mL，設(shè)定微波功率為100W，振蕩10min，進(jìn)行提取。然后過濾分離，用乙醇洗滌3遍，便得到了槲皮素。其提取率達(dá)到了63.5%。該方法不僅提取率高，而且提取時(shí)間大大縮短，節(jié)省了能源，是一

6、種適合于絞股藍(lán)中槲皮素的提取技術(shù)。3.1.3超聲波輔助提取法用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)，是目前比較新的方法。其原理主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。另外，還利用其次效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)，擴(kuò)散，擊碎等，使其加速被提取成份的擴(kuò)散，釋放。超聲波提取法大大縮短了提取時(shí)間，提高了有效成分的提取率、原料的利用率。英榮建3對超聲波法對松柏葉中槲皮素的提取進(jìn)行了研究，提取方法：采取幾種常見的松柏葉，分別取新鮮松柏葉用研缽搗碎，各取30g置于500mL的容量瓶中，并提上標(biāo)簽，每份加入95%的乙醇用超聲波提取兩次（第一次200mL，第二次150mL），每次30min，溫度為80，將每份抽濾除

7、渣，合并提取液，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器控制水浴溫度在8095，進(jìn)行常壓蒸餾濃縮，回收乙醇，便得到槲皮素，其提取率達(dá)到了68.3%。3.1.4堿溶酸水解法何勤等4人利用堿提取酸沉淀法提取槐米中的槲皮素，該方法采用正交試驗(yàn)法，得出最佳工藝為：用10倍量的0.105%氫氧化鈉溶液煮沸4次，每次20 min，調(diào)節(jié)pH值至6，取沉淀加10倍量的4%硫酸溶液微沸水解1h，得到槲皮素，其平均提取率為79.61 %。另外，戴航等5人也利用此方法提取芒果葉中槲皮素，即用飽和石灰水溶液煮沸1h，趁熱過濾，同法提取3次，濾液加酸調(diào)pH值析出沉淀，過濾后，沉淀干燥，再加酸使其水解得到不溶于水的槲皮素，過濾，水洗，

8、干燥得槲皮素固體，其提取率為 81.71%，取得了很好的效果。3.2槲皮素含量測定方法 到目前為止，進(jìn)行槲皮素含量測定的方法主要有分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法、極譜法以及相繼出現(xiàn)的聯(lián)用技術(shù)等。下面就這些測定方法做一下簡單的介紹。3.2.1紫外分光光度法紫外分光光度法主要是基于單獨(dú)的槲皮素在乙醇溶液中隨濃度不同吸光度變化較大以及槲皮素與金屬離子形成配合物(如槲皮素可分別與Fe(III)，Gr(II)等形成配合物)導(dǎo)致紫外吸收光譜發(fā)生變化而建立的一種方法。其原理是在一定pH的HAc-NaAc緩沖溶液介質(zhì)中，槲皮素與Fe(III)，Gr(II)等形成配合物，在最大吸收波長下，測定其吸

9、光度，以此來計(jì)算含量的方法。車京梅等6人用紫外分光光度法對測定水紅花子中槲皮素的含量進(jìn)行了初步測定。將槲皮素對照品溶液置于容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容。在最大波長370nm處，利用紫外分光光度法測其吸光度。建立槲皮素濃度(c)與吸光度(A)的方程：A =0.156c +0.0009,相關(guān)系數(shù)r=0.9992。待測樣品同樣用60%乙醇溶解，測定其吸光度。得到樣品回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為101.3% 和1.04%。該方法簡便快速，靈敏度和準(zhǔn)確度較高。張淑敏等7人運(yùn)用槲皮素與鐵配位，建立了用紫外分光光度計(jì)槲皮素-鐵體系測定中草藥中槲皮素含量的方法。在p

10、H=4.05的HAc-NH4Ac緩沖體系中, 槲皮素與鐵形成12的配合物，在430nm處有最大吸收。結(jié)果表明鐵的濃度在2.0×10-51.2×10 -4mol/L之間與吸光度成線性關(guān)系, 最低檢出限為2.0×10-5mol/L。周含英等8人利用該方法測定草藥中的槲皮素的含量。在表面活性劑Triton X2100的存在下，在pH=4.5的HAc-NaAc緩沖溶液介質(zhì)中，槲皮素與鎵形成21的黃色絡(luò)合物,利用UV29200型紫外可見分光光度計(jì)，在最大吸收波長為446nm，測配合物的吸光度。以吸光度A與濃度c建立的線性方程為A=0.0778c

11、(mol/L)+ 0.011，相關(guān)系數(shù)為0.9963。槲皮素的檢出限為1.26×10- 7mol/L，線性范圍為6.30×10-71.86×10-6 mol/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.1%。該方法選擇性好、靈敏度高、線性范圍寬、而且操作簡便, 應(yīng)用于中草藥中槲皮素的測定結(jié)果滿意。3.2.2熒光光度法槲皮素對金屬離子具有強(qiáng)烈的螯合作用，生成的配合物往往具有較強(qiáng)的熒光。所以金屬離子常用于槲皮素的熒光分析。如pH為5的HAcNaAc緩沖溶液中，槲皮素與鋁()形成二元熒光絡(luò)合物9。在pH為2.53.5的酸度條件下，形成槲皮素鉬()CTMAB =

12、221的黃色熒光絡(luò)合物10。在0.1008 mol/L HCl介質(zhì)中，形成n(槲皮素)n錫() = 21的熒光絡(luò)合物11。在0.54mol/L 鹽酸介質(zhì)中，有十二烷基磺酸鈉的存在下，槲皮素與鋯()和檸檬酸形成多元熒光配合物，其組成比為槲皮素鋯()檸檬酸= 12212。熒光光度法是基于測定這些熒光絡(luò)合物的熒光信號變化而建立的一種方法。黃春霞等9人利用槲皮素與鋁()形成二元熒光絡(luò)合物測定中草藥魚腥草、槐米、高良姜、柴胡中槲皮素的含量。最佳條件是在pH為5的HAcNaAc 緩沖溶液中，槲皮素與鋁()形成二元熒光絡(luò)合物，激發(fā)波長為415nm，發(fā)射波長為486nm，測定槲皮

13、素的熒光度。以熒光度F和濃度c建立線性回歸方程：F=1.874 ×106c-0.3173，r=0.9997。結(jié)果表明槲皮素濃度在4.0×10 -6mol/L1.4×10 -4mol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈正比。檢出限為2.0×10-6 mol/L。回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為100.44%和0.81%。這種方法可用于測定中草藥高良姜、魚腥草、槐米、桑寄生、柴胡中的槲皮素，結(jié)果令人滿意。余琳等11人利用在0.1008mol/L HCl介質(zhì)中, 形成n(槲皮素)n錫()= 21的熒光絡(luò)合物，且絡(luò)合物有強(qiáng)的熒光，建立靈敏、快

14、速及簡便測定槲皮素的含量光譜法。測定的最佳條件：按測定槲皮素-錫()絡(luò)合物的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，絡(luò)合物的最大激發(fā)波長為443nm, 最大發(fā)射波長為495nm。在Triton X2100的存在下，運(yùn)用F23010熒光光度計(jì)(日立公司)；721 型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)進(jìn)行測定。結(jié)果在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，槲皮素濃度范圍為8.0×10-67.2×10-5mol/L之間呈線性關(guān)系, 檢出限為 2 .2×10 -7 mol/L。其回歸方程為:F= 1.045×106c + 0 .6357，

15、r= 0.9998。其中槲皮素的濃度單位是mol/L。該方法回收率為96.03%99.33%。這種方法也可用于測定中草藥高良姜、魚腥草、槐米、桑寄生、柴胡中的槲皮素。由于溶解槲皮素所用乙醇用量對體系體系熒光強(qiáng)度影響較大，所以采用熒光分析法測定時(shí)，用乙醇溶解槲皮素時(shí)應(yīng)控制好乙醇用量，在保證槲皮素完全溶解的情況下，乙醇用量越少越好。在水溶液中，槲皮素本身沒有熒光, 其氧化產(chǎn)物有微弱的熒光。從槲皮素的結(jié)構(gòu)可以看出,它含有5個(gè)酚羥基,易于被氧化。馮瑞琴13則利用槲皮素被過氧化氫氧化后得到的產(chǎn)物與硼砂溶液混合后能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，從而建立了槲皮素過氧化氫硼砂體系檢測槲皮素的熒光方法。方法簡便，檢

16、測限較低(1.9×10- 8mol/L)，選擇性較好。3.2.3共振光散射光譜法1993年，Pasternack 等使用普通的熒光分光光度計(jì)，通過同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得光散射信號，從而建立了共振光散射(RLS)技術(shù)。此后，光散射技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于糖類和藥物分析、蛋白質(zhì)分析、核酸分析、無機(jī)金屬離子分析、納米粒子等領(lǐng)域。曾銘14發(fā)現(xiàn)槲皮素在弱酸性條件下，可以產(chǎn)生靈敏的共振光散射信號, RLS強(qiáng)度與pH值和Qu濃度有關(guān)。在一定的條件下,共振光散射強(qiáng)度與Qu濃度有較好的線性關(guān)系。理論計(jì)算的結(jié)果證實(shí)了在弱酸性條件下Qu產(chǎn)生靈敏的共振光散射峰的原因是Qu分

17、子通過分子間氫鍵作用形成了超分子聚合物, 并且從理論上得出了4位羥基上的氫原子與4位羰基氧原子之間形成分子間氫鍵最為有利的結(jié)論。嚴(yán)軍等15人在 pH 為4.86.1的BR緩沖溶液中，槲皮素(QT)和汞()形成螯合物時(shí)引起溶液共振瑞利散射(RRS)顯著增強(qiáng)，并產(chǎn)生新的RRS光譜上利用共振瑞利散射光譜法測定槐米中槲皮素的含量。實(shí)驗(yàn)方法：取槲皮素10.070.0g于10mL比色管中，依次加入 pH =5.4的BR緩沖溶液1.0mL，氯化高汞溶液1.5mL，稀釋至刻度，搖勻，放置15min后于熒光分光光度計(jì)上，以em =ex=320nm進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利

18、散射光譜，然后于最大散射峰處測量溶液的散射強(qiáng)度IRRS和試劑空白散射強(qiáng)度I0，I = IRRS-I0。取不同量槲皮素，按實(shí)驗(yàn)方法與Hg()反應(yīng)，并于320nm處測量IRRS強(qiáng)度，再以IRRS對槲皮素濃度作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的一元線性方程為I=-453.9+559.9c(mg/L),相關(guān)系數(shù)r=0.9986，線性范圍0.987.0mg/L，檢出限(3)為29.5g/L。回收率為97.1%102.6%，RSD=3.2%。共振瑞利散射光譜法靈敏度高于目前常用的某些分光光度法、熒光法和電化學(xué)分析法，這種方法儀器簡單，操作簡便、快速，可用于槐米中槲皮素含量的測定。但是由于光散射信號會受入

19、射光強(qiáng)度、溶液pH、離子強(qiáng)度、溫度、溶劑極性，儀器條件，電源電壓等多種因素的影響，測定的散射信號隨條件改變會發(fā)生變化，導(dǎo)致信號不穩(wěn)定、重現(xiàn)性較差。為了消除實(shí)驗(yàn)過程中由信號波動(dòng)帶來的誤差，彌補(bǔ)這種分析方法的不足，安春華16為以槲皮素（QT）與鋁（）的相互作用為例，建立了基于單次掃描光譜獲得共振光散射信號升降變化的一種全新雙波長比率法。根據(jù)在普通熒光光度計(jì)上單次掃描獲得的共振光散射信號的增強(qiáng)與降低的比值建立了槲皮素的光散射雙波長比率分析法，鋁（）在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中形成的羥基配合物，隨槲皮素加入，槲皮素將羥基配合物中的鋁競爭下來形成槲皮素與鋁的配合物，使得280nm處的散射強(qiáng)度（IRLS

20、60; 280)降低，444nm處的散射強(qiáng)度（I RLS  444)增強(qiáng)。結(jié)果表明Log(I RLS 280/444nm) 與槲皮素濃度在2.525×10-5 mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r=0.998，檢測限為2.5×10-6mol/L。采用這種雙波長散射比率法比單波長方法更能有效地減小外界條件變化帶來的影響，使其抗干擾能力得到明顯改善，提高了共振光散射分析法的穩(wěn)定性和簡化了雙波長比率法的操作步驟，并成功用于槲皮素的分析測定。此外，代小霞17報(bào)道了一種基于槲皮素與氯金酸作用導(dǎo)致金納米粒子AuNPs形成，然后通過普通熒光分光光度計(jì)測定金納米粒子

21、所產(chǎn)生的強(qiáng)烈的等離子共振光散射信號來檢測槲皮素(QCT)的新方法。由于槲皮素(QCT)含有性質(zhì)較為活潑的酚羥基，在堿性條件下可以和HAuCl4發(fā)生氧化還原反應(yīng)而生成AuNPs，從而導(dǎo)致溶液的顏色發(fā)生明顯變化，當(dāng)使用普通的熒光分光光度計(jì)檢測時(shí)，可以在約570nm處觀察到PRLS特征光譜。且當(dāng)HAuCl4濃度為2.0×10-4mol/L，PRLS強(qiáng)度與QCT的濃度在0.22.2×10-5mol/L的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其檢出限為0.2mol/L。推測QCT可能發(fā)生反應(yīng)的部位位于B環(huán)的3和4位置。此外，他們還設(shè)計(jì)了一種簡單的方法來對溶液中的QCT進(jìn)行粗略的定量分析，該方法使用一個(gè)4

22、.0mW便攜式激光光源或者450nm的LED光源直接照射溶液，可以直觀的觀察到溶液中的PRLS現(xiàn)象，且信號的強(qiáng)度隨著QCT濃度的增加而增加。這種方法檢測限更低，并可以粗步實(shí)現(xiàn)可視化檢測，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。3.2.4催化動(dòng)力學(xué)光度法賴曉綺等18人，在稀硫酸介質(zhì)中，槲皮素對溴酸鉀氧化乙基橙褪色反應(yīng)有明顯的催化作用，建立了測定銀杏葉中槲皮素的催化動(dòng)力學(xué)光度法。實(shí)驗(yàn)中取兩只10mL具塞刻度試管,向一只加入一定量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液,另一只不加，加入0.4 g/L乙基橙溶液0.35mL，1.00mol/L硫酸溶液0.50mL，振蕩搖勻,加入一定量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液(非催化體系不加槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液)，用水稀釋

23、至約8mL處,再加入0.05 mol/L 溴酸鉀溶液0.20mL，用水定容，搖勻。于(80±0.1)的超級恒溫器中加熱14min后，立即取出用流水冷5min以終止其反應(yīng)。以水作參比，用1cm比色皿,在507nm波長下測定非催化體系的吸光度A0和催化體系的吸光度A，計(jì)算吸光度差值A(chǔ)(A =A0 - A)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在414min范圍內(nèi)時(shí)，A與時(shí)間(t) 呈線性關(guān)系，其回歸方程為A =0.0357t-0.0927,相關(guān)系數(shù)r=0.9972，由此計(jì)算出催化反應(yīng)的總速率常數(shù)為5.95×10s。槲皮素的質(zhì)量濃度c在0.14 mg/L以

24、內(nèi)與A呈線性關(guān)系，回歸方程為A=4.972c+0.0146相關(guān)系數(shù)為0.9990。對空白進(jìn)行11次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0048，A隨溫度t的檢出限(3/ k)為0.0029 mg/L。該方法靈敏度較高、準(zhǔn)確度高、選擇性好、方法簡便、儀器簡單、對環(huán)境無污染，便于推廣，已成為檢測微量組分的有效手段。3.2.5高效液相色譜法高效液相色譜法(HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈

25、敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，如用于多種中藥(如鹿蹄草、仙草全草等)中槲皮素含量的測定。張文等19人運(yùn)用HPLC，色譜柱為Agilent  Eclipse  XDB-C18(4.6mm×150mm，5m), 流動(dòng)相為甲醇-0.1磷酸溶液(50:50)，檢測波長為370nm，流速為1.0mL/min的色譜條件測定鹿蹄草中槲皮素的含量。分別精密吸取槲皮素對照品溶液(46g/mL)2、4、6、8、10mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各進(jìn)樣10L, 連續(xù)進(jìn)樣2次，

26、測定峰面積。以對照品進(jìn)樣量x(g)為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=5.32102x-02009，r=0.9999。在0.0920.46g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吸取同一槲皮素對照品溶液10L，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積槲皮素峰面積RSD=0.58%，測得精密度較好。進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)RSD =0.82%(n=6)。在色譜條件下進(jìn)樣10L，平均回收率為99.24%，RSD = 0.70 %。另外，馮國金等20人運(yùn)用高效液相色譜法，在色譜柱為Ultimate XB-C18 柱，流動(dòng)相為乙腈:水:磷酸(45550.4)，流速為1.0

27、 ml/min，檢測波長360nm，柱溫 25為色譜條件測定仙草全草中槲皮素含量。精密稱取仙草全草樣品2g 置于索氏提取器中，加入60mL氯仿提取8h，揮干溶劑，加入60mL甲醇提取10h，濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，在色譜條件下進(jìn)20L，測定槲皮素的峰面積。以進(jìn)樣量x(g)為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 y=3739024x169，r=0.9992，式中y為峰面積，x為樣品濃度(g/mL)。結(jié)果表明，槲皮素含量在6.464g/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在色譜條件下，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，其平均回收率96.7%，RSD為1.98%(n

28、=6)。HPLC 與分光光度法相比，具有靈敏度高、效率高、分辨率高、回收率高的特點(diǎn)。但是這種方法儀器昂貴，操作繁瑣而受到限制。3.2.6薄層掃描法薄層掃描法（TLCS）是指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。王煥蕓等21人在展開劑為:甲苯-乙酸乙酯-正己烷-甲酸(10:7.5:1:1)，檢測波長為365nm的條件下.進(jìn)行雙波長(S = 260nm，R=230nm，SX=3，狹縫寬度為1.2mm×1.2mm）反射法鋸齒掃描測定蒙藥森登四味湯散中槲皮素的

29、含量，結(jié)果槲皮素在1.2486.240g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為 y=4489.559+2416.263x,r =0.9987。測定值在2h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=1.25%（n=5）。平均回收率為98.22% ，RSD=1.23% (n=5）。該法斑點(diǎn)清晰、分離度好，薄層展開后不經(jīng)顯色，可避免顯色過程所帶來的誤差。槲皮素及其它吸光雜質(zhì)干擾，減少測量誤差，且操作簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確,但該方法測量精密度低于HPLC。3.2.7薄層層析測定方法薄層層析是將吸附劑或者支持劑（有時(shí)加入固化劑）均勻地鋪在一塊玻璃上，形成薄層。把欲分離的樣品點(diǎn)在薄層上

30、，然后用適宜的溶劑展開，使混合物得以分離的方法，薄層層析是一種微量、快速的層析方法。馬應(yīng)丹等22人在展開劑為苯-醋酸乙酯-丙酮-甲酸(10821,體積比)，硅膠GF254薄層，無水乙醇作解吸溶劑，吸光度檢測波長為360nm，采用薄層層析測定方法測定銀杏葉中槲皮素的含量。實(shí)驗(yàn)方法：1、薄層層析：精確量取樣品溶液和對照品溶液各30L，分別點(diǎn)于同一塊硅膠GF254-0.15%羧甲基纖維素鈉薄層板上，用苯-醋酸乙酯-丙酮-甲酸(10821，體積比)為展開劑，上行展開7cm，取出涼干，在紫外分析儀365nm燈下觀察熒光，斑點(diǎn)顯褐色，用鉛筆勾出。2、紫外吸收測定：將上述薄層板由鉛筆勾出的與對照品槲皮素相對

31、應(yīng)的樣品斑點(diǎn)刮下并收集于離心管中，用5mL無水乙醇3 次洗滌洗脫、離心，合并上清液5mL容量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，同樣刮落沒有斑點(diǎn)存在的同面積的硅膠，同上處理成定容液作空白對照，用UV-754型紫外可見分光光度計(jì)在360nm下測定樣品定容液的吸光度。對照品點(diǎn)樣量 X(g)為橫坐標(biāo)，吸光度Y 為縱坐標(biāo)，求得其回歸方程為：Y =121339X -010250，r =0199631。槲皮素在1060g范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，最低檢測限5g，RSD =2.66 %（n=5），平均回收率91.3%。采用薄層層析法測定銀杏葉中槲皮素的含量

32、，方法精確、靈敏、線性范圍寬，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求。該法使用的試劑常見，設(shè)備簡單，在一般實(shí)驗(yàn)室和小型工廠的分析測定中值得推廣。3.2.8毛細(xì)管電泳法呂元琦等23人采用HPCE測定復(fù)方魚腥草片中的綠原酸和槲皮素含量運(yùn)行緩沖液為pH 8. 5的30mmol/L 硼砂緩沖溶液（用0.2 mol/L HAc和0.1mol/LNaOH調(diào)pH)，運(yùn)用1229高效毛細(xì)管電泳儀，工作電壓16kV，檢測波長254nm, 靜壓力進(jìn)樣(高度10cm，時(shí)間6s)。以峰高(y , mV)對質(zhì)量濃度(x, g/L ,)作圖，發(fā)現(xiàn)槲皮素在0.051.00g/L 質(zhì)量濃

33、度范圍內(nèi)成良好線性, 線性方程分別為y = 39.2679 x-0.0705(r=0.9973)。槲皮素的檢出限為0.015 g/L。加樣回收率為97%102%，峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.18%。該法實(shí)際樣品分析及加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，克服了HPLC中的缺點(diǎn)如色譜柱易污染，再生困難，壽命不長，分析時(shí)間長，不經(jīng)濟(jì)等。3.2.9極譜催化波法陳兆鵬等人24提出極譜催化波法，利用在K2S2O8溶液存在下槲皮素于-1.38V(vs. SCE)產(chǎn)生的極譜催化波，測定良姜中的槲皮素的含量。實(shí)驗(yàn)方法：吸取0.02mol/L酒石酸-酒石酸鈉( PH=2.7)1.010-2

34、mol/L的K2S2O8溶液，一定量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液于25mL容量瓶中，稀釋，搖勻。轉(zhuǎn)移部分溶液于極譜池中，用JP-2型示波極譜儀以-1.00V為起始電位作陰極化掃描，記錄二階導(dǎo)數(shù)極譜圖。測量峰電位Ep為-1.38V(vs. SCE) 處槲皮素極譜催化波的二階導(dǎo)數(shù)峰電流ip。在0.02mol/L酒石酸-酒石酸鈉( PH=2.7)1.010-2mol/L的K2S2O8底液下，槲皮素極譜催化波的二階導(dǎo)數(shù)峰電流ip與其濃度在1.010-72.0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為ip（A/s2）=1.5+2.7×107c(mol/L)，r=0.9984,n=6

35、。槲皮素催化波至少在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定不變。9 次平行測4.0×10-7槲皮素的催化波峰電流，RSD為1.5%(n=9)。平均回收率在97.6%101.3%。用此方法測定良姜中的槲皮素的含量，結(jié)果令人滿意。3.2.10示波極譜滴定法劉進(jìn)邦等25人示波極譜滴定法，由稀酸水解蘆丁生成槲皮素，堿提酸沉法提取槲皮素。在堿性介質(zhì)條件下，CrO4-可以直接氧化槲皮素。建立了以 25 %鹽酸為水解溶劑，K2CrO4 作滴定劑的分析方法。在該法中，稍過量的CrO4-在以1.5 mol/L NH4Ac-NH4OH (pH =8.0)的示波極譜底液中，可使汞膜

36、/銀電極的示波極譜圖形呈現(xiàn)敏銳切口，用以指示滴定終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法：取1.5 mol/L pH =8.0 NH4AC-NH4OH緩沖底液20mL于50mL燒杯中，再準(zhǔn)確移取4.00mL供試品溶液于燒杯中，插入電極，控溫35，啟動(dòng)恒溫磁力加熱攪拌器，然后用 K2CrO4 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴至CrO4-示波極譜圖上切口剛好出現(xiàn)即為終點(diǎn)，讀取滴定液消耗體積VK2CrO4 (mL)，按下式計(jì)算槲皮素含量:m(mg) = 3/ 2?cK2CrO4 *VK2CrO4×302.23。平均加標(biāo)回收率為98.0%99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.41%。本法簡便、

37、快速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。3.2.11電化學(xué)方法碳納米管的發(fā)現(xiàn)是世界科學(xué)史上的一個(gè)里程碑。碳納米管因其奇特的力學(xué)、電子特性、穩(wěn)定性。近十年來，它一直是世界科學(xué)研究的熱點(diǎn)。碳納米管可認(rèn)為是將石墨層折疊成圓柱體的結(jié)果，并分為單壁碳納米管 (SWNT) 和多壁碳納米管MWNT。碳納米管MWNT分散后涂布于二次石英蒸餾水中，超聲振蕩直至為均一、淺黑色玻炭電極表面，制成了MWNT化學(xué)修飾電極。MWNT 修飾電極對槲皮素具有強(qiáng)烈的吸附富集作用，致使槲皮素在修飾電極表面較大的氧化電流，在此基礎(chǔ)上建立了槲皮素的直接化學(xué)測定方法。孫延一26利用炭納米管化學(xué)修飾電極測定槲皮素的含量，利用該方法測定了蘆丁水解產(chǎn)物槲皮素的含量。實(shí)驗(yàn)條件是0.1mol/L pH= 5.0的磷酸鹽緩沖溶液，MWNT的用量為10.0L，掃描速度為100mV/s。實(shí)驗(yàn)方法：取一定量槲皮素標(biāo)準(zhǔn)于電解池中，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH = 5.0)至10mL體積，開路富集2min，從- 0.30 V開始線性伏安掃描至0.70V止，測量并記錄 0.26 V(vs. SCE)處氧化峰電流。在上述優(yōu)化條件下，氧化峰電流與槲皮素的濃度在1.0×106.0