1、玉郎傘多糖對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用              作者：段小群，焦楊，張士軍，黃仁彬【摘要】  目的研究玉郎傘多糖(YLS)對H2O2誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機理。方法采用IV型膠原酶灌流法分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用H2O2體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，檢測培養(yǎng)上清液中AST和ALT水平，測定肝細(xì)胞中MDA和 GSH含量，MTT法檢測細(xì)胞存活和增殖活性。結(jié)果YLS （0.1251 mg/ml）可明顯降低或恢復(fù)由H2O2升高的培養(yǎng)上

2、清液中AST和ALT水平及肝細(xì)胞中MDA含量，還可提高H2O2降低的肝細(xì)胞存活率和GSH含量。結(jié)論 提示YLS對大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞損傷有直接保護(hù)作用，該作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  玉郎傘多糖； 肝細(xì)胞； 過氧化氫； 抗氧化作用Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and its mechanism of Yulangsan  polysaccharide(YLS) on primary cultured rat hepatocytes injury induced by H2O2. MethodsT

3、he primary rat hepatocytes were isolated by perfusion with IV collaganase and injured by H2O2. The contents of malondialdehyde(MDA) and glutathion(GSH) in hepatocytes and the levels of AST and ALT in cultural supernatant were determined by general methods. Cell viability was assayed by MTT method. R

4、esultsThe elevation of MDA content in hepatocytes and AST and ALT levels in supernatant of cultural hepatocytes , and the decrease in cell viability and GSH content induced by H2O2 were restored remarkably by the treatment with YLS（0.1251 mg/ml）.ConclusionThe results suggest that YLS possesses direc

5、t protective action on primary hepatocyte injury induced by H2O2. This might be associated with the anti-oxidative activity of YLS.Key words：Yulangsan Polysaccharide(YLS);   Hepatocyte;   H2O2 ;   Anti-oxidative activity   玉郎傘是一種尚未開發(fā)利用的民間草藥，為蝶型花科植物疏葉巖豆 Millett

6、ia pulchra Kurz var. laxior(Dunn)Z Wei 的塊根。具有散淤、消腫止痛之功能，民間用于高血壓、肝炎、消化不良等的治療，本課題組經(jīng)多年研究證實玉郎傘提取物具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，并對急、慢性實驗性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用1，2。玉郎傘多糖（Yulangsan  Polysaccharide YLS）是玉郎傘提取物中主要的有效成分，為進(jìn)一步研究YLS對肝損傷的作用，本文采用IV型膠原酶灌流法分離肝實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型進(jìn)行體外研究，觀察YLS對體外肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機制。1  器材1.1 

7、; 動物  Wistar大鼠，雌雄不拘，體重(230±30)g；由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK 桂20030003，實驗動物使用許可證：SYXK 桂20030005。1.2   藥物及試劑 YLS，由本室自行提取（分離得到的YLS多糖經(jīng)Sephadex-75凝膠柱層析，硫酸-苯酚法以及高效凝膠滲透色譜法證實為高純度多糖，純度95%，紫外掃描顯示無核酸和蛋白特征吸收峰，薄層色譜和氣相色譜表明由葡萄糖和阿拉伯糖組成，紅外光譜顯示有典型的多糖吸收峰）；IV型膠原酶(Sigma公司)；RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭

8、州四季青公司)；H2O2(重慶川江化學(xué)試劑廠)；維生素E(Sigma公司)；臺盼藍(lán)(SigmaT6146，北京拜爾迪生物公司分裝)；噻唑藍(lán)（MTT，Amerisco，北京拜爾迪生物公司分裝）；DHanks緩沖液（自配）；Hanks緩沖液（自配）；二甲基亞砜（DMSO，天津化學(xué)試劑有限公司）；天門冬氨酸轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛(MDA)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；谷胱甘肽(GSH)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。1.3   儀器  HL2型恒流泵（上海精科實業(yè)有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國The

9、rmo Forma，Model 311）；TDL802B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XD-101倒置顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）； SZX型超凈工作臺（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；722 s型可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；450型酶標(biāo)儀（美國BioRad）。2  方法2.1  大鼠原代肝細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 3，4大鼠用20%烏拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，無菌操作下，打開腹腔，將腸管推向左側(cè)，暴露門靜脈和下腔靜脈，小心分離穿線各一根，門靜脈穿刺靜脈留置針，退出針芯，結(jié)扎牢固。將留置管連接輸液管，開啟恒流泵，灌流37預(yù)熱DHanks液，流

10、速15 ml/min，迅速剪開下腔靜脈放血。同時打開胸腔暴露并結(jié)扎上腔靜脈。灌流約10 min后，肝臟顏色呈黃白色。下腔靜脈插入硅膠管，結(jié)扎牢固。改用含0.05% IV型膠原酶的Hanks液（37預(yù)熱）15 ml/min，約15 min后，肝臟軟化，壓之凹陷不易恢復(fù)，迅速取下完整肝臟，連同含膠原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，輕柔擺動肝組織，讓細(xì)胞慢慢游離出來，200目篩過濾得細(xì)胞懸液。600 r/min離心，棄上清，沉淀加1640培養(yǎng)液吹打混勻，800 r/min離心，共洗滌兩次。用血球計數(shù)板（臺盼藍(lán)拒染法）測定細(xì)胞活率及細(xì)胞密度。用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，肝

11、細(xì)胞活力大于90%。將上述肝細(xì)胞懸液加入96孔和24孔培養(yǎng)板中，置37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，肝細(xì)胞全部貼壁生長，供試驗用。2.2   YLS對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的作用5,6維生素E作陽性對照，用少量DMSO溶解，加入到培養(yǎng)液后其終濃度為50 mol/ml。   取上述貼壁生長的肝細(xì)胞，設(shè)H2O2模型組、YLS（0.1251）mg/ml 4個劑量組和空白對照組、維生素E組，每組至少設(shè)6個復(fù)孔。分別加入H2O2 0.6 mmol/L，不同濃度的YLS,維生素E和溶媒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清檢測AST,ALT活性；棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，

12、加入0.2 ml Triton-100水溶液0.5 ml，混勻，2 500 r/min離心10 min，取上清測定肝細(xì)胞MDA和GSH含量，同時用MTT比色法，測定肝細(xì)胞的活率。2.3   MTT比色法待測細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，各孔加入20 l MTT試劑，輕輕混勻，繼續(xù)37培養(yǎng)4 h，吸出全部液體，加200 l DMSO，微量振蕩器上振蕩15 min，待溶解完全，于酶標(biāo)儀570 nm波長比色。2.4   賴氏法測定AST和ALT按試劑盒說明測定。2.5   MDA和GSH含量測定按試劑盒說明測定。2.6 &

13、#160; 數(shù)據(jù)處理  所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計處理。         3  結(jié)果   結(jié)果見表1。3.1   YLS對H2O2損傷肝細(xì)胞ALT和AST活性的影響  H2O2損傷肝細(xì)胞后，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)酶的釋放，模型組的ALT，AST水平較正常組明顯升高，YLS在（0.1251）mg/ml劑量范圍內(nèi)，能顯著抑制H2O2損傷肝細(xì)胞后ALT，AST水平的上升，并呈明顯的劑量依賴性；VitE也能明顯抑制H2O2損傷肝細(xì)胞后ALT

14、，AST水平的上升。3.2   YLS對H2O2損傷肝細(xì)胞MDA和GSH的影響  H2O2損傷肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞中的MDA明顯升高，GSH則顯著降低，除YLS0.125 mg/ml外，其余YLS各劑量組均能顯著提高H2O2損傷肝細(xì)胞中的GSH含量和降低H2O2損傷肝細(xì)胞中的MDA含量，并呈明顯的劑量依賴性；VitE對H2O2損傷肝細(xì)胞也具有提高GSH含量和降低MDA含量的作用。3.3   YLS對H2O2損傷肝細(xì)胞活性的影響  MTT法測定結(jié)果表明，H2O2損傷后模型組細(xì)胞活性明顯下降，YLS在（0.1251）mg/ml劑量范圍內(nèi)，能顯

15、著恢復(fù)和升高H2O2損傷肝細(xì)胞后的細(xì)胞活性，并呈明顯的劑量依賴性；VitE也能恢復(fù)和升高H2O2損傷肝細(xì)胞后的細(xì)胞活性。表1  YLS對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的作用（略）與H2O2組比較， *P0.05，*P0.01，與對照組比較，P0.05，P0.01；n=64  討論   在肝細(xì)胞損傷過程中,氧自由基（oxygen free radical，OFR）起了重要作用。OFR及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物(LPO)可引起激烈的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生幾十種毒性分子，再次誘發(fā)成  1 焦 楊，段小群，黃仁彬，等. 玉郎傘提取物對超氧陰離子自由基和羥自由基的抑制和清除

16、作用J.廣西醫(yī)科大學(xué)報,2004,21(1)：22.2 黃仁彬，段小群，焦 楊，等.玉郎傘提取物對小鼠急性化學(xué)性肝損傷保護(hù)作用及其機制的研究J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003,20(6)：874.3 Solis-Herruzo JA, De La Torre P, Minoz-Yague MT, et al.Hepatic stellate cells(HSC)：architects of hepatic fibrosisJ.Rev Esp Enferm Dig, 2003, 95：438.4 Safadi R，F(xiàn)riedman SL， et al. Hepatic fibrosis-role o

17、f hepatic stellate cells activationJ.Med Gen Med , 2002, 4：27.5 Zhu B，Liu G T.Cytotoxic effect of hydrogen peroxide on primary culutured rat hepatocytes and its mechanismsJ.Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 1996, 10(4):260.6 Borikov OIu, Kaliman PA. The effect of cadmium chloride and h

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