1、遺傳毒性試驗能檢出DNA員傷及其損傷的固定。根據(jù)檢測的遺傳學終點分為4種類型：1檢測基因突變（比如：Ames試驗）；2檢測染色體畸變（比如：微核試驗）；3檢測染色體組畸變（比如：體外CHL細胞染色體畸變、精原細胞染色體畸變試驗）；4檢測DNAfM始損傷（比如：單細胞凝膠電泳分析（singlecellgeleletrophoresis,SCGE）。以上檢測結(jié)果為呈陽性（除外假陽性）的化合物，為潛在人類致癌劑和/或致突變的物質(zhì)。FDA于2006年制定了遺傳毒性試驗結(jié)果的綜合分析法指導原則（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachest

2、ointegrationofgenetictoxicologystudyresults）對遺傳毒性試驗的陽性結(jié)果評價和處理：ICHS2（R1）中的遺傳毒性結(jié)果評價和追加試驗策略。目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。1現(xiàn)行組合試驗方案，用一組試驗配套進行試驗。200多種檢測方法中，真正經(jīng)過驗證有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。目前多數(shù)國家規(guī)定，如體內(nèi)誘變13t驗顯示1個或以上試驗呈陽性結(jié)果，則需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。2各類遺傳毒性試驗方法的研究進展2.1 檢測基因突變2.1.1 Ames試驗Ames試驗是檢測化學物質(zhì)基因突變的常用方法。常規(guī)的Amesi式驗選用四個測試菌株（T

3、A97、TA98、TA100TA102），最近有人提出增加TA1535測試菌株，該菌株特別適用于檢測混合物的致突變性。目前出現(xiàn)的新生菌株具有更高的敏感性和特異性，如YG7014TG7108，缺乏編碼O6-甲基鳥喋吟DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的ogtST基因，專用于對烷化劑引起的DNA損傷本測；引入乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的YG1024YG1029菌株，對硝基芳煌和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上4。測試代謝活化系統(tǒng)一般采用由Aro-clor1254（PCBs）誘導大鼠肝微粒體酶的S9;國外也有用人肝S9的報道，試驗證明其代謝活性明顯高于鼠S95,6。為了克服S9制備上的困難和不穩(wěn)定性Josephy等將沙門氏

4、菌的芳香胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和人類細胞色素P-450基因Cyp1A2弓I入細胞，構建了在無外源S9時也可檢出芳香胺誘變性的Ames測試菌株如DJ4501A27。2.1.2 TK基因突變試驗TK基因突變試驗是一種哺乳動物體細胞基因正向突變試驗，近年來其應用價值有明顯的提高。TK基因編碼胸背激酶，該酶催化胸背的磷酸化反應，生成胸背單磷酸（TMP）。如果存在三氟昔（TFT）等喀咤類似物，則產(chǎn)生異常的TMP,摻入DNA中導致細胞死亡。如受檢物能引起TK基因突變，胸昔激酶則不能合成，而在核昔類似物的存在下能夠存活。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)

5、的多種遺傳改變。試驗采用的靶細胞系主要有小鼠淋巴瘤細胞L5178Y以及人類淋巴母細胞TK6和WTK傳。其基因型均為tk+/-。Honma體間正充）和張立實（1999）指出原用染毒時間36h對于充分檢出斷裂劑和錘體來說這個時間太短，獲陰性結(jié)果時應延長至24h。據(jù)資料顯示對于同一陽性受檢物，WTK1細胞的突變頻率遠高于TK6細胞，認為與WTK1存在p53基因突變有關。Do-brovolsky（1999）建立了tk+/-轉(zhuǎn)基因小鼠，可用于體內(nèi)試驗。2.1.3轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗可在整體狀態(tài)下檢測基因突變，比較不同組織（包括生殖腺）的突變率，確定靶器官，對誘發(fā)的遺傳改變作精確分

6、析等8。1989年Gossen等報道了LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠突變測試系統(tǒng)。近年來，國外已陸續(xù)發(fā)展了多種用于突變檢測的轉(zhuǎn)基因動物，其中3種已投入商品化生產(chǎn)，MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠，它們分別采用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。陳建泉等人（1997）已經(jīng)以穿梭質(zhì)粒pESnx載體，以xy1E基因因為誘變靶基因建立了攜帶xy1E的轉(zhuǎn)基因小鼠，并對轉(zhuǎn)基因小鼠進行了繁殖建系。并已實驗證明xy1E轉(zhuǎn)基因小鼠是一個研究體內(nèi)基因突變的有效模型，它可望成為一種新的轉(zhuǎn)基因小鼠突變檢測系統(tǒng)9。Heddle等（2000）建立了1個種gptdelta轉(zhuǎn)基因

7、小鼠。HiroyukiHayashi等（2003）將載有E.coligpt基因和入噬菌體的red/gam基因入EG10DN整合到SD大鼠每個單倍體基因組q24q31位點。這種轉(zhuǎn)基因大鼠對乙基亞硝基月尿（ENU）和苯并花（BaP）的肝臟毒性顯示了很好的敏感性，它也有助于研究遺傳毒性物質(zhì)對小鼠和大鼠的種間差異10。反向限制性酶切位點突變分析法（inverserestrictionsitemutation,iRSM）由英國威爾士大學分子遺傳和毒理中心建立并完善的11。iRSM適用于快速檢測誘變劑所致體內(nèi)外DNA的突變，但這些突變的特點是使某一酶切位點變?yōu)榱硪幻盖形稽c。該方法建立者Jenkins等首先

8、將iRSM應用于化學誘變劑所致動物體內(nèi)p53基因的突變檢測，取得了良好的結(jié)果：小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基月尿（ENU）、2-乙酰氨基蕩（2-AAF）和二甲基酰腫（DMH）3天后，以iRSM方法相應地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內(nèi)含子區(qū)域的Apa-Ava位點反向突變。結(jié)果表明ENUW發(fā)肝組織p53基因突變的發(fā)生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發(fā)生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應組織的致突變強度，進一步驗證了該方法的高靈敏度和準確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變檢測部位明確等優(yōu)點，應當說是一種較具實用價值和生命力的突變檢測手段。但是，iRSM的不足之

9、處是僅能檢測誘發(fā)限制性酶切位點反向的DNA突變。根據(jù)文獻資料分析，化合物致突的發(fā)生具有一定的規(guī)律性，即結(jié)構類似的一組化合物常常引起一些特定序列較固定的堿基改變。例如，烷化劑和芳香胺類雖易使一連串鳥喋吟（G）3端G發(fā)生突變12,13,這可能與該部位電荷密集有關，多數(shù)活性氧生成物質(zhì)的DNA致突作用也具有類似規(guī)律14;CpG二核昔常常是DNA加成物致突變作用部位15,所以CpG突變的檢測在化合物致突卞測中具有重要意義，而CpG突變常引發(fā)某些固定酶切位點的變化。很顯然,iRSM可較廣泛地應用于遺傳毒性化合物致突作用的檢測。檢測染色體和染色體組畸變微核試驗傳統(tǒng)的體內(nèi)微核試驗仍然是檢測化學物質(zhì)染色體損傷的

10、基本方法。目前微核試驗方法主要有以下改進:1體外微核試驗常用細胞有中國倉鼠肺細胞（CHL）、中國倉鼠卵巢細胞（CHO）及中國倉鼠成纖維細胞（V79）等，近年開始有用L5178Y小鼠淋巴瘤細胞和人的類成淋巴細胞TK6。也有用敘利亞倉鼠胚胎(SHE)細胞和BALB/c3T3細胞。體外試驗比體內(nèi)試驗易于操作和控制。缺點是對直接彳用的化合物有可能出現(xiàn)假陽性。2周圍血微核試驗優(yōu)點是可重復采樣，自身對照，減少實驗動物數(shù)。李尊愛(1999)報道剛斷乳不久的小鼠(46周齡)用于外周血網(wǎng)織紅細胞微核試驗比年齡更大的敏感些16。3胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗(CB-MNT)很好地排除了細胞分裂的影響。該法中，雙核細胞是

11、只分裂了一次的細胞，其結(jié)果更加穩(wěn)定敏感。CB-MNTT觀察到多種遺傳學終點。觀察不同分裂期的細胞比例，計算核分裂指數(shù)能檢測誘變物對細胞周期的影響。還可檢測切除修復，次黃喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)位點變異，凋亡。認為該試驗可使計數(shù)值提高，達到傳統(tǒng)方法的兩倍或以上。但也偶小于兩倍的結(jié)果(李來玉，1996)。最近Garriott和Phelps等推薦了關于體外雙核細胞微核試驗的幾個參數(shù)條件：細胞松弛素B不影響試驗結(jié)果；計數(shù)2000個雙核細胞；長時間暴露沒有必要；結(jié)果用趨勢檢驗分析；根據(jù)相應的細胞毒性選擇適當?shù)臐舛?7。染色體畸變試驗染色體畸變試驗是檢測化學物質(zhì)影響染色體數(shù)量和結(jié)構的基本方法。在化學

12、物質(zhì)安全性評價中常選體外CHL細胞染色體畸變、精原細胞染色體畸變試驗等檢測化學物質(zhì)對染色體的影響。為了準確觀察誘發(fā)的畸變頻數(shù)，本試驗收獲細胞的時間應盡量提前至大多數(shù)細胞處于染毒后第1次有絲分裂時(Tucker,1996)。對于染色估數(shù)目改變，原則上只適合超倍體的觀察。因為涂片時可能人為地把染色體推出細胞外(Tucker,1997),Danford曾建議在制備標本時減弱低滲處理能力，以免漲破細胞膜，從而能準確觀察亞二倍體。經(jīng)研究，認為以0.094mo1/LKC1弱低滲液處理2min3min是達此目的的最佳條件(樓鐵柱，1997)。熒光原位雜交(FISH)技術熒光原位雜交最早由Bauman(198

13、0)建立，后由Lucas(1989)首先應用于染色體畸變分析。其原理是按檢測目標準備恰當?shù)腄NA列作為探針，并用生物素標記，對載玻片上待測標本中的DNA雜交，最后通過雜交位點的熒光觀察染色體結(jié)構或數(shù)目的改變。應用特殊染色體和染色體某區(qū)域的熒光探針可在體內(nèi)檢測4種類型的細胞遺傳學終點18。1檢測中期細胞染色體畸變。2應用亞染色體區(qū)域的探針檢測間期染色體斷裂和非整倍體。3應用中心粒探針和/或抗著絲點抗體檢測微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST可接免疫熒光法，以及小鼠次要和主要衛(wèi)星DNA|針，在小鼠骨髓細胞證明了受試物引起微核的來源19。4哺乳動物精子非整倍體檢測。徐德

14、祥(1999)用雙色FISH方法對丙烯睛接觸男工精子性染色體數(shù)目畸變進行了檢測，證明FISH技術用于檢測精子染色體數(shù)目畸變實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。檢測DNAM始損傷單細胞凝膠電泳技術單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創(chuàng)的，以后經(jīng)Singh等(1988)進一步完善而逐漸發(fā)展起來的一種快速檢測單細胞DNAi員傷的實驗方法，因其細胞電泳形狀頗似慧星，又稱慧星試驗(cometassay)。Kizilian(1999)改進了一些試驗條件，能明顯將細胞調(diào)亡和細胞壞死的形象與“彗星”區(qū)分。MarkS.Rundell等(2003)報道彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的20。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種