1、()一. 九種表達載體Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA二. 克隆載體PTZ19RDNAPUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptllKS()L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三. PET系列表達載體Protei nExpressi on ?ProkaryoticExpressi on? pETDsbFusi on Syste

2、ms39ba nd40bProtei nExpressi on ?ProkaryoticExpressi on? pETExpressi on System33bProtei nExpressi on ?ProkaryoticExpressi on? pETExpressio nSystemsProtei nExpressio n?ProkaryoticExpressi on? pETExpressi on SystemsplusCompete ntCellsProtei nExpressi on ?ProkaryoticExpressi on? pETGSTFusio nSystems41a

3、 nd42Protei nExpressio n?ProkaryoticExpressi on? pETNusAFusi on Systems43.1a nd44Prote in Expressi on ?ProkaryoticExpressi on? pETVectorDNAProtei nPurificatio n?Purificatio nSystems?Strep?Tacti nRes insan dPurificatio nKits四P GEX系列表達載體TEcoR?pGEX-1l/BAPpGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X pGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGE

4、X-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五 P TYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表達載體pCDNA3.1(-) pCDNA3.1() pPICZalphaA pGAPa A PYES2.0 pBI121 pEGFP-N1 pEGFP-C1 pPIC9K pPIC3.5K如何閱讀分析質粒圖譜載體主要有病毒和非病毒兩大類，其中質粒DNA是一種新的非病毒轉基因載體。一、一個合格質粒的組成要素復制起始位點Ori?即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。

5、而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如Amp ?,Ka n多？克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段P/E?啟動子/增強子Terms終止信號?加poly ( A)信號？可以起到穩定 mRN作用二、如何閱讀質粒圖譜第一步：首先看 Ori的位置，了解質粒的類型(原核 /真核/穿梭質粒) 第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。(1) Ampr水解酰胺環，解除氨芐的毒性。(2) tetr可以阻止四環素進入細胞。(3) camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。(4) neor ( kanr )氨基糖苷磷酸轉移酶使 G418(長那霉素衍生物)失活(5)

6、 hygr使潮霉素3失活。第三步：看多克隆位點(MCS。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以與如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體?？寺≥d體中參加一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。啟動子-核糖體結合位點-克隆位

7、點-轉錄終止信號啟動子促進 DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與 RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。？增強子/沉默子-為真核？基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過 程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子一負增強子，負調控序列。核糖體結合位點/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs): mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG(起始密碼)和 SD序列。？轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子

8、中有一個AATAAA的保守序列，此位點 down- stream有一段GT或T富豐區，這2局部共同構成poly (A)力口 尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down- stream有一段GT或 T富豐區，這2局部共同構成poly (A)加尾信號。？答復有人之前提出的一個問題：為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈 DNA它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基 因在另一條鏈上三、介紹一下關于載體的知識雖然課本上都有寫1. 什么是載體即要把一個有用的基因目的基因一一研究或應用基因通過基因工程手段送到生物細胞

9、受體細胞，需要運載工具交通工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體vector 。P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA2. 載體的分類按功能分成：1克隆載體都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中 復制擴增。它是用來克隆和擴增 DNA片段基因的載體。所以有時實驗時擴增效率低下， 要注意是不是使用的嚴謹行載體2表達載體具有克隆載體的根本元件ori,Ampr,Mcs等還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。按進入受體細胞類型分： 1原核載體2真核載體3穿梭載體sbuttlevector 指在兩種宿主生物體復制的載體

10、分子，因而可以運載目的基因穿梭往返兩種生物之間P.S.穿梭質粒含原核和真核生物 2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。3. 基因工程載體的3個特點：一都能獨立自主的復制： 載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如MCS插在其中的外源 DNA片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。二都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。三都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中別離純化出來。4. 載體的選擇和制備：選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中

11、應有適宜的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，那么要選擇適宜的表達載體。載體選擇主要考慮下述 3點：1 構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇適宜的克隆載體/表達載體。2 .載體的類型：1 克隆載體的克隆能力據克隆片段大小大選大，小選小。如10kb選質粒。2 表達載體據受體細胞類型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。3 對原核表達載體應該注意 3點： 選擇適宜的啟動子與相應的受體菌； 用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位； 表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。3 載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于，不產 生閱讀框架錯位。選用質粒最常用做載體的4點要求： 選分子量小的質粒，即小載體1 1.5kb不易損壞，在細