1、藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1101 藥品直接接觸包裝材料 ( 容器) 是藥 品 不 可 或缺的組成局部，伴隨著藥品生產、流通及使用的全過 程，亦是對藥品質量進行評價的一項重要指標1 2。 國家食品藥品監督管理局于 2002 2004 年先后頒 布實施了 六 冊 共 48 個品種的藥品包裝材料標準 ( 藥包材) 、25 個有關檢測方法及一個指導原那么，其 中對直接接觸藥品、不洗即用且無后續滅菌工藝的藥 包材規定了微生物限度或無菌檢查項3 5。口服液 體藥用塑料瓶直接接觸液體藥品，其微生物污染勢必 會影響藥品質量，甚至影響患者的用藥平安。因此本 實驗

2、以口服液體藥用塑料瓶為實驗對象進行微生物 限度檢查，分析污染狀況，以控制其在生產，流通及使 用過程中的可能產生的污染因素，保證藥品質量。2方法參照國家藥品包裝容器 ( 材 料) 標 準 ( 試 行)YBB000920024、2021 年版中國藥典二部微生物限度檢查法6及美國藥典 36 版7進行實驗，簡述如下。2. 1菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30 35 培養 18 24 h; 接種白色念珠菌的新 鮮培養物至改進馬丁培養基中，23 28 培養 24 48 h。上述培養物用 0. 9% 的無菌氯化鈉溶液制成 每 1 mL 含菌

3、數為 50 100 cfu3的菌懸液。接種黑 曲霉的新鮮培養物至改進馬丁瓊脂培養基中，23 28 培養 5 7 d，參加 0. 9% 的無菌氯化鈉溶液3 5 mL，將孢 子 洗 脫。吸 出 孢 子懸液至無菌試管內，用 0. 9% 的無菌氯化鈉溶液制成每 1 mL 含孢子數1儀器與材料WJ 6 無 菌 檢 查 儀 ( 天 津市羅根科技有限公 5司) ，一次性薄膜過濾器( 規格: NS01 75D2 ; 批號:20211128; 孔徑: 0 45 m; 材質: 尼龍膜) ，生化培養箱( 德國 Binder 公司) ，Phoenix 100 型全自動細菌鑒 定試驗系統( 美國 BD 公司) ，Cry

4、stal Spec 型比濁儀( 美國 BD 公司) 。2021 年全國評價性抽驗中得到的 4 個品 種、9 種規格、43 家企業的 55 批樣品，其中口服液體藥用 聚酯瓶( 20、30、40、60、100、120、150、180、200 mL 瓶 1 ) 31 批; 口服液體藥用高密度聚乙烯瓶( 10、20、60、100、200 mL瓶 1 ) 17 批; 口服液體藥用聚丙烯 瓶( 10、30、100 mL瓶 1 ) 5 批; 口服液體藥用聚丙 烯易折瓶( 10、100 mL瓶 1 ) 2 批。培養基: 胰酪大豆胨瓊脂、膽鹽乳糖增菌液、玫瑰 紅鈉瓊脂、營養瓊脂、營養肉湯、改進馬丁、改進馬丁 瓊

5、脂的批號分別為 120730、1204192、1205072、110503、120626、110524、120213，北京三藥科技開發，靈敏度實驗符合 2021 年版中國藥典規定6。為 50 100 cfu 的孢子懸液。供試液制備取供試品 16 瓶，照微生物限度檢查法( 中國藥 典 2021 年版二部附錄J) 6，加 0. 9% 無菌氯化鈉 溶液至 1 /2 標示容量，將蓋旋緊，振搖 1 min，取全部 提取液，備用。2. 22. 3細菌、霉菌和酵母菌計數檢查驗證試驗薄膜過濾法: 分別量取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌大腸埃希菌和白色念珠菌的菌懸液，黑曲霉孢子懸液 1 mL，加 0. 9% 的無

6、菌氯化鈉溶液分別稀 釋至 10 mL 作為驗證菌備用。取 1 瓶提取液，全量 通過濾膜后，參加驗證菌，濾過，將濾膜貼至營養瓊 脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上，細菌置 35 培養 24 48 h; 霉菌和酵母菌置 25 培養 48 72 h，觀察結果。2. 4細菌、霉菌和酵母菌計數檢查試驗薄膜過濾法: 取 16 瓶提取液，分別全量通過濾膜枯 草 芽 孢 桿 菌 ( Bacillussubtilis) CMCC后，將濾膜分別貼至 8 個營養瓊脂瓊脂培養基平板和8 個玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上，細菌置 35 培養72 h; 霉菌和酵母菌置 25 培養 5 d，觀察結果。B63501、金 黃 色 葡

7、 萄 球 菌 ( Staphylococcusaureus )CMCC B 26003 、銅 綠 假 單 胞 菌 ( Pseudomonasaeruginosa) CMCC( F)10104、大腸埃希菌( Esche-2. 5需氧菌總數計數檢查驗證試驗薄膜過濾法: 分別量取金黃色葡萄球菌、銅綠假richia coli) CMCC B 44102、白色念珠菌 ( Candi-da albicans) CMCC F 98001，中國醫學細菌保藏 中心; 黑曲霉( Aspergillus niger) CMCC F 98003， 中國食品藥品檢定研究院。試劑: 鑒定培養液、革蘭氏陽性細菌鑒定 / 藥

8、敏 板、革 蘭 氏 陰 性 細 菌 鑒 定 / 藥敏板的批號分別為 2107002、2046476、2088399，碧迪醫療器械上海有限 公司。單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌菌懸液，黑曲霉孢子懸液 1 mL，加 0. 9% 的無菌氯化鈉溶液分別稀釋 至 10 mL 作為驗證菌備用。取 1 瓶提取液，全量通過 濾膜后，參加驗證菌，濾過，將濾膜貼至胰酪大豆胨瓊 脂培養基平板上，30 35 培養 5 d，觀察結果。2. 6控制菌檢查驗證實驗取 8 瓶 提 取 液，全 量 通 過 濾 膜 后，將 濾 膜 加 至藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1102 100

9、 mL 膽鹽乳糖增菌液，再參加含菌數為 50 100cfu 的大腸埃希菌懸液，30 35 培養 24 48 h，觀 察結果。2. 7 需氧菌總數計數檢查試驗薄膜過濾法: 取 8 瓶提取液，分別全量通過濾膜 后，將濾膜分別貼至 8 個胰酪大豆胨瓊脂培養基平 板上，30 35 培養 5 d，觀察結果。2. 8 控制菌檢查實驗取 8 瓶 提 取 液，全 量 通 過 濾 膜 后，將 濾 膜 加 至100 mL 膽鹽乳糖增菌液，30 35 培養 24 48 h，觀察結果。2. 9污染菌株分析 使用無菌棉簽挑取從口服液體藥用塑料瓶中分離的污染菌落至鑒定培養液中，混勻，使用比濁儀調 節菌液濃度在 0. 5

10、0. 6 McF 范圍內。將菌液倒入 藥敏板，將藥敏板放入全自動細菌鑒定試驗系統進 行菌株分析。33. 1結果與討論微生物限度檢查法的建立 根據國家藥品包裝容器 ( 材料) 標準 ( 試行) 規定，口服液體藥用塑料瓶的細菌、霉菌和酵母菌數:每瓶 不 得 過 100 cfu; 每 1 瓶 不 得 檢 出 大 腸 埃 希 菌4。按照 2021 年版中國藥典二部微生物限度檢 查法6以及 美 國 藥 典 36 版采用薄膜過濾法結合 2021 年版中國藥典中規定的常用驗證菌株6 7這 2 種微生物限度檢查方法，對口服液體藥用塑料瓶進 行細菌、霉菌和酵母菌、需氧菌總數檢查以及控制菌 檢查的驗證試驗。采用薄

11、膜過濾法時，以上 2 種微生物限度檢查 方法的 5 株驗證菌的 3 次回收率均為 70% 以上( 采 用 2021 年版中國藥典檢查方法的試驗結果見表 1， 采用美國藥典 36 版檢查方法的試驗結果見表 2 ) ， 證明了方法的有效性。表 1 口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查驗證試驗結果( 中國藥典 2021 年版薄膜過濾法)Tab 1esults of validation test for microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in ChP 2021)陽性菌平

12、均回收率( average recovery of positive strains) / %樣品( sample)供試品組( test group )大腸埃希菌( E coli)枯草芽孢桿菌( B subtilis)金黃色葡萄球菌( S aureus)白色念珠菌( C. albicans)黑曲霉( A. niger)口服液體藥用聚酯瓶( medicinal polyester bottle for oral liquid)098979799100口服液體藥用高密度聚乙烯瓶( medicinal polypropylene bottle for oral liquid)099969598100

13、口服液體藥用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottlefor oral liquid)09695979398口服液體藥用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottle fo oral liquid)010098999799服液體藥用塑料瓶進行了微生物限度檢查，污染菌數均未超過 7 cfu瓶 1 ( 表 3、4) ，其中采用 2021 年 版中國藥典中規定的細菌計數方法未檢出污染微生物為 34 批，占 62% ( 表 3) ，其中所有樣品均未檢出 污染霉菌和酵母菌; 采用美國藥典 36 版規定的需氧 菌總數計

14、數方法未檢出污染微生物為 32 批，占58% ( 表 4) 。所有樣品分別采用以上 2 種微生物限度檢查方法均未檢出大腸埃希菌。結合細菌、霉菌和酵母菌計數以及需氧菌總數計數的驗證試驗結果，進行控制菌檢查的驗證實驗。當采用薄膜過濾法，能滿足控制菌檢查的根本要求。3. 2口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查結果 按照建立的口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查方法和微生物限度檢查標準，采用細菌、霉菌和酵 母菌計數以及需氧菌總數計數這 2 種微生物限度檢 查方法對 4 個品種、9 種規格、43 家企業共 55 批口藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1103 表 2 口服

15、液體藥用塑料瓶微生物限度檢查驗證試驗結果( 美國藥典 36 版薄膜過濾法)Tab 2esults of validation test for microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in USP 36)陽性菌平均回收率( average recovery of positive strains) / %樣品( sample)供試品組( test group )大腸埃希菌( E coli)枯草芽孢桿菌( B subtilis)金黃色葡萄球菌( S aureus)白色

16、念珠菌( C. albicans)黑曲霉( A. niger)口服液體藥用聚酯瓶( medicinal polyester bottles for oral liquid)0999998100100口服液體藥用高密度聚乙烯瓶( medicinal polypropylene bottles of oral liquid)099979698100版口服液體藥用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)09898999799口服液體藥用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bot

17、tles for oral liquid)010098999799表 3 口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查結果( 中國藥典 2021 年版薄膜過濾法)Tab 3 esults of microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in ChP 2021)細菌數( bacterial count) / cfu per bottle樣品( sample)批號( batch No )1#2#3#4#5#6#7#8#130501130220130401130201121222130

18、3046130113130411110101151431361212111232011114222221661022014401000472023014001000660020004000000273040000000000050040000000000000050000口服液體藥用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottles for oral liquid)2021040120210204130402202103012021040820210309202104042021040113011213031212100312101622000000口服液體藥用高密度聚

19、乙烯瓶( medicinal high density polyethylene bottles for oral liquid)22114130122123200370035000300000口服液體藥用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)2021052001320000藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1104 口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查結果( 美國藥典 36 版薄膜過濾法)表 4Tab 4 esults ofmicrobial limit

20、test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in USP 36)需氧菌總數( TAMC) / cfu per bottle樣品( sample)批號( batch No )1#2#3#4#5#6#7#8#口服液體藥用聚酯瓶( medicinalpolyester bottles for oral liquid)1304031305011302201111211220400000000000001304010221100013020112122213030461301131304111011511123

21、221660004700066000270000500000202104011212030020210204130402202103012021040843130111022002300200040004000500202103096111000020210317001210002021040414444000口服液體藥用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottles for oral liquid) 口服液體藥用高密度聚乙烯瓶( medicinal high density polyethylenebottles for oral liquid)202104012

22、200000013011213031212100312101622114130122123200370035000300000口服液體藥用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)20210520013200003. 3污染菌株的分析結果采用全自動細菌鑒定試驗系統對從口服液體藥3. 4. 1提取液制備方法對實驗結果的影響由于塑料瓶具有透氣、透濕和吸附作用，經過高溫注吹的塑料瓶，在包裝、運輸、存放過程中容易受到微生物 污染12，因 此，本實驗采用參加 含 驗 證 菌 的 0. 9%無菌氯化鈉 溶 液

23、 至 塑 料 瓶 中，充 分 振 搖，薄 膜 過 濾后，將濾膜貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上培養， 觀察結果，計算回收率，回收良好。結果證明，使吸 附在瓶壁的污染微生物能被更徹底地洗脫下來，從而提高檢出率。用塑料瓶中檢出的污染菌進行菌株鑒定。檢出里拉微球菌、變異微球菌( 易變微球菌) 、放射形根瘤菌、緩慢葡萄球菌、表皮葡萄球菌、玫瑰微球菌、糞產堿 桿菌、枯草芽孢桿菌、陰道加德納氏菌、溶血葡萄球菌、豬葡萄球菌、頭狀葡萄球菌頭狀亞種、多殺巴斯 德氏菌、西地細菌 EO 2 群、施氏葡萄球菌施氏亞 種、環狀芽孢桿菌、短芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大 芽孢桿菌、人 葡 萄 球 菌、淺 綠 氣 球 菌 (

24、綠 色 氣 球 菌 /龍蝦加夫基 氏 菌) 、馬 紅 球 菌、浸 麻 類 芽 孢 桿 菌、水生棒狀桿菌、地衣芽孢桿菌、共計 25 株污染菌。不 同樣品中的污染菌沒有規律性，提示其為隨機污染。 上述污染菌株多為環境常見菌，沒有危害性較大的致病菌8。3. 4實驗操作對結果的影響3. 4. 2沖洗方法對實驗結果的影響 由于直接采用薄膜過濾器的針頭很難將塑料瓶中的提取液全部取出，且在操作時容易造成污染。所以，應將塑料瓶 內的提取液全部移至適宜的無菌容器中( 輸液瓶) ，再進行薄膜過濾，從而提高實驗結果的準確性。對口服液體藥用塑料瓶微生物限度檢查方法3. 5的探討藥物分析雜志 Chin J Pharm

25、Anal 2021，34( 6) 1105 微生物限度檢 測) J Tianjin Pharm ( 天 津 藥 學 ) ，2003，15( 4) : 21KUANG Pei lin ( 匡 佩 琳) Discussion about membrane filtra- tion method in microbial limit test for packaging materials of drug( 關于藥品 包裝材 料微生物限度檢查的商 榷) J DrugStand China( 中國藥品標準) ，2006，7( 1) : 70National Drug Packaging Contain

26、ers( Material) Standard ( Trial)國家藥品 包 裝 容 器 ( 材 料) 方 法 標 準 ( 試 行) S 2004:Vol 1 6( 第 1 6 輯)LIU Qian ( 劉 倩 ) ，ZHANG Yuan ( 張 媛 ) ，GAO Hua ( 高 華 ) Biosafety suggetions in current National Drug Pakaging Contain-ers ( Material) standard( 對現行?國家藥 品 包 裝 容 器 ( 材 料) 方法標準?中生物平安相關標準的幾點修改建議) J Chin J Pharm Ana

27、l( 藥物分析雜志) ，2021，32( 10) : 1889ChP 2021 Vol ( 中國藥典 2021 年版 二部) S 2021: Ap- pendix( 附錄) 107USP 36 NF 31S 2021: 61FANG Hai( 房海) ，CHEN Cui zhen( 陳翠珍) ，ZHANG Xiao jun( 張曉 君) Pathogenic Bacteria of Enterobacteriaceae ( 腸 桿 菌科病原細菌) M Beijing ( 北 京 ) : China Agricultural Sci- ence Press( 中國農業科技出版社) ，2021:

28、89ChP 2021 The Second Supplement ( 2021 年 版 中 國 藥 典 第 二 增補本) Appendix ( 附 錄) H 非無菌產品微 生 物 限 度 檢 查: 微 生 物 計 數 法 ( Microbial Limit Test of Non sterileProducts: Counting of Microorganisms) EB / OL 2021 2 26 : / / www chp org cn / cms / newscenter / subjects /2021 ydzbzqyj /000029 htmlEP 6. 0S 2007: 166

29、BP 2002S 2002: 315JP 14S 2000: 60YOU Ya ning ( 由 亞 寧 ) ，CHEN Xue qin ( 陳 雪 芹 ) ，ZHOU Zhi yun( 周志云) ，et al Compare the colony counting method between the 2005 version Chinese Pharmacopeia and the mainly overseas pharmacopeia ( 2005 年 版?中 國 藥 典 ?和?歐 洲 藥 典?菌落計數培養基比擬) J Chin Pharm Aff( 中國藥事) ，2021，24( 6) : 587LU Jun( 魯軍) ，OUYANG Su ying( 歐陽素英) Study for mi- crobial limit inspection method of eye drug plastic tube( 塑 料 滴 眼瓶微生物限度檢查方法探討) J Huaihua Univ J( 懷化學 院學報) ，2007，26( 2) : 11( 本文于 2021 年 9 月 4 日收到)按照 目 前 國 內規定的藥包材微生物計數方 法4，要求對口 服 液 體藥用塑料