1、異體骨髓干細胞移植后假肥大型肌營養(yǎng)不良癥模型鼠膈肌dystrophin表達及病理改變 作者：張雅妮；張成；于美娟；王淑輝；李美山；黃慧；熊符；馮善偉；柳太云；盧錫林(中山大學第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東  廣州  510080)摘要：目的  探討骨髓干細胞移植對假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD)模型鼠-mdx鼠膈肌的治療效果。方法  取雄性SD大鼠骨髓干細胞經(jīng)尾靜脈植入放療處理后的8周齡雌性mdx鼠(n=18)，于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行HE染色、抗肌萎縮蛋白(dystrophin)免疫熒光檢測以及dyst

2、rophin mRNA的RT-PCR分析，同時用正常C57鼠及放療而未移植的mdx鼠作為對照，另進行PCR反應檢測實驗鼠膈肌內(nèi)Sry(Y染色體的性別決定區(qū))基因。結(jié)果 移植后mdx鼠膈肌間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤較放療而未移植mdx鼠有所減少；移植后核中心移位纖維比例移植后4、8、12周分別為(15.58±0.91)%、(12.50±1.87)%、(10.17%±1.17)%較未移植mdx鼠(19.5±1.87)%顯著減少。移植后dystrophin免疫熒光陽性細胞比例移植后4、8、12周分別為(1.00±0.32)%、(6.00±1.05)

3、%、(11.92±1.11%)較未移植mdx鼠(0.17±0.41)%顯著增加。RT-PCR結(jié)果顯示C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相對含量(0.63±0.04)最高；而未移植mdx鼠的膈肌中未檢測到dystrophin mRNA；移植后的mdx鼠膈肌中mRNA的表達水平(移植后4、8、12周分別為0.19±0.05、0.26±0.06、0.36±0.04)隨時間推移逐漸增高；移植后各時間點mdx鼠膈肌Sry基因均為陽性。結(jié)論  骨髓干細胞系統(tǒng)移植mdx鼠可以恢復部分膈肌的dystrophin表達，改善

4、膈肌的病理,骨髓干細胞移植有希望成為全身治療DMD的有效方法。關(guān)鍵詞：假肥大型肌營養(yǎng)不良癥；mdx鼠；膈肌；骨髓移植；抗肌萎縮蛋白中圖分類號：R392.4; R457.7  文獻標識碼：A  文章編號：1673-4254(2006)01-0053-06Dystrophin expression and pathology of diaphragm muscles of mdx mice after xenogenic bone marrow stem cell transplantationZHANG Ya-ni；ZHANG Cheng；YU Mei-j

5、uan；WANG Shu-hui；LI Mei-shan；HUANG Hui；XIONG Fu；FENG Shan-wei；LIU Tai-yun；LU Xi-linDepartment of Neurology, First Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, ChinaAbstract: Objective To investigate the effect of bone marrow stem cell transplantation (BMT) on the diaphragm muscles of mdx mi

6、ce, a mouse model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Methods The bone marrow-derived stem cells form male SD rats was transplanted through the tail vein into 18 female 8-week-old mdx mice, which were sacrificed at 4, 8 and 12 weeks after BMT (6 at each time point), respectively. The diaphragm mus

7、cles of the mice were subjected to HE staining, immunofluorescence detection of dystrophin, reverse transcription (RT)-PCR analysis of dystrophin mRNA transcripts and PCR analysis of Sry (sex-determining region on the Y chromosome) gene, with age-matched female C57 mice and untreated mdx mice as the

8、 controls. Results The proportion of centrally nucleated fibers (CNF) in the diaphragm muscle of the recipient mdx mice was (15.58±0.91)%, (12.50±1.87)% and (10.17±1.17)% at 4, 8 and 12 weeks after BMT, respectively, significantly smaller than that of untreated mdx mice (19.5±1.8

9、7)%, and the fibers after BMT showed less inflammatory infiltration. Compared with the untreated mice, the recipient mdx mice showed green fluorescence on significantly more diaphragm muscle cell membranes with the proportion of dystrophin-positive fibers of (1.00±0.32)%, (6.00±1.05)% and

10、(11.92±1.11)% at 4, 8,  and 12 weeks after BMT. RT-PCR of dystrophin mRNA also demonstrated significantly higher relative levels of dystrophin in the recipient mdx mice (0.19±0.05, 0.26±0.06 and 0.36±0.04 at 4, 8 and 12 weeks after BMT) than in untreated mdx mice, and S

11、ry gene was present in the recipient mice. Conclusions BMT can partially restore dystrophin expression and ameliorate the pathology in the diaphragm muscles of mdx mice, and has great potential to produce general therapeutic effect in patients with DMD.Key words: Duchenne muscular dystrophy; mdx mic

12、e; diaphragm; bone marrow transplantation; dystrophin收稿日期：2005-10-20基金項目：國家自然科學基金(30370510，30170337)，廣東省自然科學基金(31693)，衛(wèi)生部臨床重點項目基金(2001321),高等學校博士學科點專項科研基金(20030558058)，教育部骨干教師基金(082004)Supported by National Natural Science Foundation of China (30370510，30170337),Natural Science Foundation of Guangdo

13、ng Province (31693), Key Clinical Research Fund of Ministry of Health (2001321), Research Fund for Doctoral Program of Higher Education(20030558058)and the Foundation of Backbone Teachers of the Ministry of Education (082004).作者介紹：張雅妮(1977-)，女，在讀博士研究生，從事神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病研究，電話E-mail：zhangyanimon

14、ica通訊作者：張 成，電話E-mail: czym     假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是一種致死性X連鎖隱性遺傳病，由位于染色體Xp21.2的抗肌萎縮蛋白 (dystrophin) 基因突變導致肌細胞膜的骨架蛋白dystrophin缺乏所致。患者常在12歲左右不能行走，20 歲左右死于呼吸衰竭或心力衰竭，其中絕大多數(shù)患者由于膈肌萎縮而死于呼衰。對DMD的治療至今仍無良方，只有糾正或彌補其基因缺陷才能從根本上治療DMD。基于此點，細胞治療日受矚目。成肌細胞移植只能用于局部注射，治療部位局限，難以治療心肌與膈肌損害，靜脈移植

15、時dystrophin表達量少且易造成血管栓塞，同時免疫排斥反應強烈而難以持久表達，而骨髓干細胞被認為是目前最有前途的候選細胞之一。    骨髓中的造血干細胞和間充質(zhì)干細胞經(jīng)實驗證實具有自我更新和多向分化潛能，可分化成包括肌肉組織在內(nèi)的多種組織。1999年，Gussoni等1將C57雄鼠的骨髓細胞經(jīng)尾靜脈注入放療后的雌性mdx鼠，觀察到供體來源的dystrophin表達，建立了骨髓移植治療DMD的方法。mdx小鼠是目前應用最廣泛的DMD模型鼠，過去的DMD細胞治療實驗側(cè)重觀察mdx鼠的肢體骨骼肌，忽視了對膈肌療效的評價，而后者對移植療效和預后的評價可提供

16、不可忽視的證據(jù)。    本實驗采用大鼠骨髓干細胞經(jīng)尾靜脈對放療后的mdx鼠進行移植，觀察移植后膈肌的病理改變和抗肌萎縮蛋白的表達情況，以評價骨髓干細胞系統(tǒng)移植對mdx鼠膈肌的治療效果。    1  材料和方法    1.1  實驗動物    原代純合子mdx配種鼠(C57BL/10ScSnDMD mdx)購于美國Jackson實驗室，實驗所用mdx鼠為原代配種所生。雄性SD大鼠(60-80g)10

17、只作為供體鼠；正常野生型C57BL/6雌性小鼠6只(12-16周齡)作正常對照組；雌性mdx鼠(8周齡)18只進入移植治療組；經(jīng)放療但未治療的雌性mdx鼠(12-16周)6只作未治療組。上列實驗用鼠均有動物合格證。    1.2  主要實驗試劑    兔抗鼠dystrophin多克隆抗體、山羊抗兔FITC IgG二抗(Santa Cruz 公司)，引物合成(上海生物工程技術(shù)服務有限公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，DNA提取試劑盒(上海華舜生物

18、工程有限公司)，Tag酶(MBI公司)，低糖DMEM細胞培養(yǎng)液(GIBCO公司)。    1.3  實驗方法    1.3.1  mdx鼠移植前放療預處理方案  在細胞移植前3天對mdx 鼠進行放療預處理：放療視野30.0 cm ×30.0 cm，治療距離80.0 cm，治療深度2.0 cm，照射劑量7 Gy，劑量率73.19 cGy/ min。實驗鼠于照射前后隔離運輸，照射后送校實驗動物中心隔離飼養(yǎng)。加氟哌酸、復合維生素B等入飼料水，并加雞蛋、

19、葵花子飼養(yǎng)，2周后改為一般飼料。    1.3.2  骨髓干細胞移植  放療同日取供體SD大鼠10只，乙醚麻醉后引頸處死，取后肢股骨、脛骨骨髓干細胞培養(yǎng)，方法同文獻2。細胞培養(yǎng)3 d 后,將培養(yǎng)液及懸浮骨髓干細胞移入15 ml 試管。培養(yǎng)瓶內(nèi)加少許無血清低糖DMEM培養(yǎng)基,反復沖洗貼壁細胞；將沖洗后的細胞懸液移入15 ml 試管，3 000 r/ min離心5 min。棄上清，再用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并離心，重復2 次，制備適量細胞懸液 ，并計數(shù)細胞，檢測細胞活力達98 %以上。取8周齡經(jīng)放療預處理的m

20、dx鼠經(jīng)尾靜脈進行移植，移植細胞數(shù)為1.0×107個/只，每只注射0.4 ml，每次吸取細胞液前將其混勻，注射順利、無外滲為移植成功。對照組6只經(jīng)放療預處理的mdx鼠從尾靜脈注入等體積無血清DMEM作空白對照。    1.3.3  移植后模型鼠膈肌組織HE染色  分別取移植后4、8、12周的治療鼠和對照鼠膈肌用OCT包埋，投入在液氮中預冷的異戊烷7-8 s后，放入冰凍切片機切片，厚度為5 m，將切片在冷丙酮固定10 min后行常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，鏡下觀察結(jié)果并拍照。鏡下觀察內(nèi)容為肌細胞的形態(tài)、排列

21、、一致性、變性壞死情況、核中心移位纖維(CNF)比例等。CNF比例=CNF細胞數(shù)/總纖維數(shù)。每只鼠觀察6張切片，每張切片連續(xù)取6-10個非重疊視野，取其均值作結(jié)果。    1.3.4  移植后肌肉組織的dystrophin免疫熒光檢測  取移植后4、8、12周mdx鼠及對照鼠的膈肌做冰凍切片(具體同前)，用冷丙酮固定10 min后置于-80 冰箱待用。具體方法為：PBS洗3×5 min；3%H2O2封閉10 min，PBS洗3×5 min；正常山羊血清于室溫濕盒內(nèi)封閉30 min，甩去封閉血清，

22、每種切片滴加兔抗鼠dystrophin 50 l(1200)，4 過夜；室溫放置30 min，PBS洗3×5 min；滴加山羊抗兔IgG-FITC(1200)，室溫下濕盒內(nèi)孵育60 min，PBS洗3×5 min。Olymbus熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照，每只鼠觀察6張切片，每張切片連續(xù)取6-10個非重疊視野，計算熒光陽性纖維占總纖維比例，取其均值作結(jié)果。    1.3.5  移植后膈肌組織dystrophin的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)  取新鮮C57鼠、對照組mdx鼠以及治療組各個時間

23、點的mdx鼠的膈肌按照TRIzol法制備RNA，分別取1 g RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。大鼠dystrophin及內(nèi)參GAPDH的CDNA引物使用Oligo 5.0自行設計，引物序列見表1。將dystrophin與GAPDH分別擴增，PCR擴增體系完全相同： DNA2.0 l，dNTP0.2 mmol/L，Mgcl22.0 mmol/L，10×Buffer3.0 l，Taq酶1unit，引物各0.5 mol/L，去離子水補至總體積30 l。循環(huán)參數(shù)為：94 預變性5 min，94 變性40 s，60 退火45 s，72 延伸1 min，34個循環(huán)，72 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂

24、糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，Gel2Doc200 型凝膠成像分析儀拍照，使用alpha-imager 2800軟件分析條帶的灰度值，dystrophin的相對量用dystrophin灰度/GAPDH灰度表示，從而進行半定量分析。     1.3.6  移植后膈肌組織大鼠Sry基因的PCR檢測  取凍存于-70 冰箱的移植后各時間點及未移植mdx鼠與雄性SD大鼠膈肌，按照試劑盒說明提取并保存DNA。大鼠Sry基因引物序列F：5'CTGGCTCTGC T CCTACCT3'；R：5'GCTGTTT

25、GCTGCCTTTGA3'。PCR擴增體系：DNA1.0 l，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl2 22.0 mmol/L，10×buffer 3.0 l，Taq酶1 l，引物各0.5 mol/L，去離子水補至總體積30 l。循環(huán)參數(shù)：95 預變性5 min，94 變性30 s ，54 退火45s ，72 延伸50 s，32 個循環(huán)后再72 延伸7min。反應產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，Gel2Doc200 型凝膠成像分析儀拍照，所得片段大小應為325 bp。    1.4  數(shù)據(jù)統(tǒng)計 

26、   均數(shù)用±s表示，利用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析，方差齊者組間比較用S-N-K檢驗，方差不齊者用Games-Howell檢驗，P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。    2  結(jié)果    2.1  骨髓移植后mdx鼠的膈肌病理檢測    正常C57鼠的膈肌可見肌細胞大小形態(tài)基本一致，細胞排列緊密，細胞多呈多角形，少數(shù)為橢圓形，細胞輪廓清晰、完整，未見變性壞死肌細胞，胞核位于細

27、胞周邊，CNF比例為(0.83±0.68)%，間質(zhì)無炎性細胞浸潤，纖維結(jié)締組織含量少。未治療的mdx鼠膈肌內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，肌細胞數(shù)量明顯減少，肌細胞橫截面積大小不一，有萎縮和肥大細胞，多角形細胞減少，細胞多成橢圓形，大量脂肪和纖維組織浸潤，炎性細胞浸潤明顯增多，肌細胞核中心移位明顯，CNF比例為(19.5±1.87)%。移植后膈肌細胞較非移植組炎性浸潤有所減少，CNF比例顯著低于非移植組，且隨時間推移遞減移植后4、8、12周分別為(15.58±0.91)%、(12.50±1.87)%、(10.17±1.17%)。經(jīng)兩兩比較后，各組間差異

28、均有顯著性(表2、圖1)。     圖1  不同組間膈肌HE染色病理學檢查    Fig.1  Pathology of the diaphragm muscles (HE staining)    A: The diaphragm muscle fibers of C57 mice in the cross sections are polygon or oval in shape, with clear and intact mar

29、gin and nuclei in the peripheral portion. There was no inflammatory and connective tissue infiltration (Original magnification: ×400); B: In the diaphragm muscle of untreated mdx mice, the size of the fibers in transverse sections varied enormously with atrophy or hypertrophy. Some fibers showe

30、d degenerative and necrotic changes. Obvious inflammatory cell infiltration and replacement by fat and connective tissue can be seen (Original magnification: ×200); C: Diaphragm muscles of a recipient mouse 12 weeks after BMT the percentage of CNF in the treated mdx mice significantly decreased

31、 as compared with untreated mdx mice. The fibers were in more orderly alignment with less inflammatory cell infiltration; (Original magnification: ×400)    2.2  移植后mdx鼠膈肌組織dystrophin表達的動態(tài)變化    2.2.1  免疫熒光檢測dystrophin的表達變化  dy

32、strophin免疫熒光檢測后可見C57鼠膈肌肌膜呈均勻完整的綠色熒光，熒光陽性細胞比例為100%(圖2A)；未治療mdx鼠膈肌肌膜基本未見綠色熒光(0.17±0.41)%(圖2B，表2)； mdx鼠治療后4周膈肌內(nèi)可見孤立分布的肌膜dystrophin陽性細胞，約占細胞總數(shù)的1.00%±0.32%，熒光較弱且不均，胞膜著色不全。隨時間延長陽性細胞逐漸增多，到移植后8周和12周時分別達到細胞總數(shù)的(6.00±1.05)%和(11.92±1.11)%(圖2C，表2)，自移植后8周開始可見部分熒光陽性細胞成簇狀分布，熒光較移植后4周強，雖胞膜著色仍欠均勻，但

33、熒光強度及完整性增強。兩兩比較后發(fā)現(xiàn)各組間陽性細胞比例差異均有顯著性意義(表2)。     圖2  不同組間膈肌的dystrophin免疫熒光檢測    Fig.2  Immunofluorescent detection of dystrophin in the diaphragm muscles    A: Homogenous green fluorescence shown on all the fiber membranes

34、of C57 mice (Original magnification: ×400); B: Very little fluorescence in the untreated mdx mice (Original magnification: ×400); C: Dystrophin expression in the diaphragm of a recipient mdx mice 12 weeks after BMT (Yellow asterisks indicate fibers with dystrophin expression on the fiber m

35、embrane; original magnification: ×400).    2.2.2  膈肌dystrophin的RT-PCR結(jié)果  C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相對含量最高(0.63±0.04)；未移植的mdx鼠膈肌中未檢測到dystrophin mRNA；經(jīng)移植治療的mdx鼠膈肌mRNA的表達水平隨時間推移逐漸增高(移植后4、8、12周分別為0.19±0.05、0.26±0.06、0.36±0.04)。兩兩比較后各組間差異均有顯著意義

36、(表2、圖3)。     圖3  膈肌dystrophin及GAPDH的RT-PCR電泳結(jié)果    Fig.3  Representitive result of RT-PCR analysis of dystrophin and GAPDH mRNA in the diaphragm    M: Marker; Lane 1: C57 mouse; Lane 2: Untreated mdx mouse; Lane 3: Recipi

37、ent mdx mouse 4 weeks after BMT, 4: Recipient mdx mouse 8 weeks after BMT; 5: Recipient mdx mouse 12 weeks after BMT    2.2.3  膈肌Sry基因檢測  各組mdx雌鼠膈肌DNA經(jīng)PCR擴增Sry基因片段，結(jié)果顯示未移植小鼠膈肌內(nèi)無Sry基因，而移植后各時間點的mdx鼠膈肌內(nèi)均存在Sry基因(圖4)。     圖4  膈肌Sry基因PC

38、R電泳結(jié)果    Fig.4  Representitive result of PCR analysis of Sry gene in the diaphragm    M: Marker; Lane 1: Untreated mdx mouse; Lane 2: Male SD rat; Lane 3: Recipient mdx mouse 4 weeks after BMT; Lane 4: Recipient mdx mouse 8 weeks after BMT; Lane 5: R

39、ecipient mdx mouse 12 weeks after BMT    3  討論    骨髓干細胞內(nèi)含有多種類型的細胞，包括間充質(zhì)干細胞、造血干細胞等，以往的研究證實它們具有多向分化的潛能，可在體內(nèi)或體外分化為包括肌肉組織在內(nèi)的多種組織34，并可自我更新。同時輸注混合干細胞可以利用細胞間的相互協(xié)同支持作用，盡早恢復造血功能，最大程度的達到治療目的。研究表明骨髓干細胞包括間充質(zhì)干細胞和造血干細胞均可向病灶器官和組織定向遷移，其機制尚不明確，推測可能為干細胞受到病變局部的某些物質(zhì)的吸引而

40、定向遷移到該區(qū)域并定居。有人5發(fā)現(xiàn)大鼠腦卒中模型的卒中腦組織勻漿液可以在體外有效的吸引經(jīng)培養(yǎng)純化的骨髓間充質(zhì)干細胞。另有研究發(fā)現(xiàn)造血干細胞可以定向遷移到心肌梗死大鼠的病變心肌組織6。骨髓干細胞的多向分化、自我更新潛能以及向病變組織的定向遷移的特點，使其成為細胞移植治療DMD的理想候選。    mdx鼠(C57BL/10ScSn-Dmd,mdx;X-linked muscular dystrophy)是基于C57BL/10的突變小鼠，位于dys基因的3185位堿基發(fā)生了無義突變(CT)，導致dystrophin蛋白的合成提前終止。mdx鼠出生后3-4周開始

41、出現(xiàn)骨骼肌病變，其中膈肌的壞死最先發(fā)生。肌肉組織循環(huán)出現(xiàn)壞死再生，CNF便是再生而又不成熟的肌細胞 。mdx鼠包括腓腸肌在內(nèi)的大部分骨骼肌細胞的病理與人類DMD有所不同，變性、壞死、炎性細胞浸潤為主，而脂肪和結(jié)締組織增生不明顯。但其膈肌的病變類似于人類DMD，3周左右出現(xiàn)病變后將逐漸加重，最終膈肌細胞被大量脂肪和結(jié)締組織替代。mdx心肌細胞的病變早期較輕微7。由于mdx鼠的膈肌病變更類似于人類DMD的骨骼肌病變，應在今后的模型鼠研究中更好的加以研究和利用。本實驗中未治療組mdx鼠膈肌冰凍切片的病理結(jié)果進一步支持上述研究結(jié)果，可見大量炎性細胞浸潤，肌細胞數(shù)量明顯減少，肌細胞橫截面積大小不一，有萎

42、縮和肥大細胞，可見變性壞死纖維，脂肪和纖維結(jié)締組織增生明顯，核中移肌細胞明顯增多CNF比例為(19.50±1.87)%，與Liu8的研究結(jié)果相似。    1999年，Gussoni1等將C57雄鼠的骨髓造血干細胞、全骨髓細胞以及SP細胞經(jīng)尾靜脈移植入雌性mdx鼠，分別于5、8、12周后取脛前肌進行dystrophin免疫熒光檢測。在全骨髓移植后的第8周觀察到供體來源的dystrophin表達，dystrophin陽性細胞數(shù)為1%，12周后達到10%。實驗結(jié)果同時表明骨髓造血干細胞和SP細胞均可以在體內(nèi)分化為骨骼肌細胞。本課題組以往的研究9也證實

43、骨髓細胞移植可以使mdx小鼠的后肢肌肉表達dystrophin。然而以往的報道中未見骨髓移植對于膈肌的治療效果。本實驗中，骨髓干細胞移植后4周可見mdx小鼠的膈肌中有dystrophin免疫熒光陽性肌細胞，占肌細胞總數(shù)的1%左右，隨時間延長逐漸增加，到8周和12周分別增加到(6.00±1.05)%和(11.92±1.11)%，顯著高于未移植鼠，證明增多的dystrophin陽性肌細胞歸功于干細胞移植；RT-PCR也從RNA水平證實了dystrophin的存在，其mRNA的表達量也隨時間推移逐漸增加，與免疫熒光檢測結(jié)果一致。同時在未經(jīng)治療的mdx鼠的膈肌也發(fā)現(xiàn)了極少量的dys

44、trophin陽性纖維(0.17±0.41)%，應為可回復肌纖維，與Crawford 等10的報道一致。 HE染色后發(fā)現(xiàn)移植后mdx小鼠的膈肌較移植前有所改善，細胞間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤有所減少，核中心移位細胞數(shù)隨時間延長遞減，說明外源性的dystrophin表達使mdx鼠膈肌的變性壞死減少，起到一定的保護作用，這與Feng8的研究一致。本實驗結(jié)果進一步證實骨髓干細胞在體內(nèi)可以分化為骨骼肌細胞，并且經(jīng)系統(tǒng)移植后可以分布到mdx鼠病理改變最嚴重與最典型的膈肌。    我們選擇大鼠Y染色體特異的Sry基因作為遺傳標志，采用PCR 技術(shù)通過擴增Sry 基

45、因部分序列觀察雄性供體細胞在雌性受體內(nèi)的表達，結(jié)果在移植后各時間點的mdx小鼠膈肌均檢測到Sry 基因，進一步證實移植組mdx 鼠膈肌內(nèi)日益增多的dystrophin 陽性肌細胞來源于供體雄鼠，證實移植成功。    LaBarge11等追蹤運動致肌肉損傷時GFP骨髓干細胞移植分化為肌細胞的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞不僅轉(zhuǎn)化為肌細胞而且可轉(zhuǎn)化為肌衛(wèi)星細胞，尤其當接受后肢放療使體內(nèi)衛(wèi)星細胞破壞時GFP細胞與衛(wèi)星細胞池結(jié)合的能力增強，提示骨髓干細胞移植后向肌細胞的演變過程可能與健康肌細胞的發(fā)育過程基本相同，即先成為肌衛(wèi)星細胞，而后逐步發(fā)育為肌細胞。據(jù)此，我們推論

46、，外源性骨髓干細胞經(jīng)靜脈移植mdx鼠后(大部分歸巢到骨髓)，在嚴重病變的膈肌所表達的炎性趨化因子的吸引下，動員入血、穿過膈肌血管到達膈肌，先轉(zhuǎn)變?yōu)榧⌒l(wèi)星細胞，隨后在局部刺激因素的作用下逐步發(fā)育成肌細胞。    總之，本實驗采用大鼠骨髓干細胞經(jīng)尾靜脈移植治療DMD模型鼠mdx鼠，從肌肉病理、免疫熒光和mRNA、DNA的水平證實供體細胞成功植入受體小鼠的膈肌，進一步證實了骨髓干細胞移植有希望在今后成為全身治療DMD的有效方法。    (責任編輯：吳錦雅)    參考文獻：

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