1、病毒TCID50測(cè)定操作步驟(1) 準(zhǔn)備細(xì)胞 取出一塊細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔大約傳800010000個(gè)細(xì)胞（一個(gè)T25瓶的細(xì)胞消化后加10ml培養(yǎng)液正好傳一塊96孔板，要傳勻）。每個(gè)孔的細(xì)胞鋪成單層大約60豐度即可接種病毒（下午傳好板第二天早上就能用）。細(xì)胞對(duì)照選取16個(gè)孔即可。滴定與對(duì)照可以在一塊培養(yǎng)板上進(jìn)行，操作中注意不要竄孔。也可以分別在不同的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，但要保證實(shí)驗(yàn)條件一致。(2) 稀釋待測(cè)病毒液。A法為參考書(shū)上標(biāo)準(zhǔn)的操作方法B法參照書(shū)將液體量減少后的結(jié)果病毒稀釋液根據(jù)是否需要胰酶來(lái)選擇適合的液體，無(wú)論哪種都無(wú)血清。A向每支試管中加入1.8ml病毒稀釋液。向1號(hào)試管中加入0.2ml病

2、毒，依次10倍系列稀釋至適宜濃度，最后一支試管。B在EP管中用無(wú)血清的孵育液10倍倍比稀釋病毒原液(10-1，10-210-10等)，根據(jù)病毒大致的滴度確定稀釋的倍數(shù)。首次滴定可以多稀釋幾個(gè)滴度。根據(jù)接種的孔數(shù)稀釋病毒，常規(guī)每個(gè)稀釋度接種4孔，則每個(gè)稀釋度配500µl，即10-1為50µl加入450µl的孵育液中；如每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，則各配制1ml，即10-1為100µl加入900µl孵育液中。若接種8個(gè)孔，則相應(yīng)增加液體量。上述的配液并不是固定不變的，可以根據(jù)接種的量自行調(diào)整。【！此步操作注意事項(xiàng)：1）建議每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，若要統(tǒng)計(jì)分

3、析則還要增加至16個(gè)孔。2）病毒稀釋過(guò)程中一定將病毒液與孵育液充分混勻。2）此過(guò)程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，并用紫外線(xiàn)照射20min，確保無(wú)菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺(tái)（或安全柜中打開(kāi)）。】(3) 接種取細(xì)胞培養(yǎng)板，用多道加樣器（又稱(chēng)排槍?zhuān)┪?6孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因?yàn)檠迥芨蓴_病毒的吸附）。將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根據(jù)觀察的習(xí)慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度（10-1，10-2 ）到原液加樣。【切記：設(shè)置正常的細(xì)胞對(duì)照。每次實(shí)

4、驗(yàn)要重復(fù)4次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。】37CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，取出培養(yǎng)板吸去病毒液（從低濃度向高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200µl繼續(xù)在37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4) 培養(yǎng)1 / 7將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)溫度     ，培養(yǎng)    天。(5) 測(cè)定結(jié)果取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。計(jì)算方法1) Spearman-Karber 法    LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×R1/N1）    

5、0;    X0 = 全部病變最低稀釋度對(duì)數(shù)     d = 稀釋因數(shù)對(duì)數(shù)     N1 = 每個(gè)稀釋度所種的孔數(shù)     R1 = 病變孔數(shù)                       = 積和 LgCCID50 /ml = L

6、gCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench法觀察CPE, 找出能引起半數(shù)細(xì)胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數(shù)，按計(jì)算出該病毒液的TCID50TCID50 是指組織培養(yǎng)物（細(xì)胞）半數(shù)致死計(jì)量。它有幾個(gè)性質(zhì)我們必須明白：1）它表示的是計(jì)量，不是濃度； 2）它是一個(gè)單位；3）它的值等于1，實(shí)際上問(wèn)它的值等于多少是一個(gè)沒(méi)有意義的問(wèn)題，就像問(wèn)km的值等于多少一樣，如果非要說(shuō)出的的值等于多少，那我們只能說(shuō)它的值在任何情況下都等于1。理解這三個(gè)性質(zhì)對(duì)于理解TCID50非常重要，但是這三個(gè)性質(zhì)經(jīng)常被誤解，所以導(dǎo)致對(duì)TCID50的理解出現(xiàn)偏差。首先我們來(lái)看一下這個(gè)表示法的意思：病毒濃度為108.

7、2TCID50/ml它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2個(gè)TCID50的病毒，這和氯化鈉的濃度為4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5個(gè)mol的氯化鈉是一樣的道理。經(jīng)常可以聽(tīng)到人說(shuō)我的病毒的TCID50是10xx。這個(gè)說(shuō)法是不科學(xué)的，應(yīng)該說(shuō)我這個(gè)溶液里含有多少個(gè)TCID50的病毒或者說(shuō)我這個(gè)溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.理解了TCID50的概念之后，我們?cè)賮?lái)看看TCID50是如何計(jì)算的？請(qǐng)看例子： 每個(gè)所加液體的體積是0.08ml。圖中給出的計(jì)算方法是有問(wèn)題的，請(qǐng)先忽略不看。從圖中我們可以知道半數(shù)致死的稀釋度肯定是介于10-6到107之間，肯定可以表示成10-6.xx。那么這個(gè)

8、.xx到到底是多少呢？這實(shí)際上是一個(gè)線(xiàn)性插值的問(wèn)題。求解見(jiàn)下圖： PD/log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)=(%next above 50%)-50%/(%next above 50%)-(%next below 50%)注意：如果你的病毒是以3倍3倍地稀釋那么上面這個(gè)公式的log就應(yīng)該是以3為底的log，其他稀釋度與此相類(lèi)似。在本例子中PD/(-6)-(-7)=(80%-50%)/(80%-0%)PD=0.375log(50的致死的稀釋度)=-6-0.375=-6.375求解得到50的致死的稀釋度為10-6.375根據(jù)TCID50的

9、定義，就把這個(gè)稀釋度所含的病毒的量定義為1個(gè)TCID50.在本例中即定義把病毒稀釋到106.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量為1個(gè)TCID50.接下來(lái)我們就可以根據(jù)這個(gè)定義來(lái)求原液的病毒溶度。通常求解每ml含有多少個(gè)TCID50的病毒。我們先要來(lái)求解這個(gè)問(wèn)題：已知把病毒稀釋到106.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量為1個(gè)TCID50，那么病毒原液直接取0.080ml有多少個(gè)TCID50.很顯然0.080ml病毒原液有106.375個(gè)TCID50。再求解1ml有多少個(gè)TCID50就簡(jiǎn)單了：設(shè)1ml這樣的病毒原液就有x個(gè)TCID50x/1ml106.375/0.080mlx=1

10、06.375/0.08=2.9*108所以每ml這樣的病毒原液有2.9108個(gè)TCID50，即該病毒原液的溶度為2.9*108TCID50/ml如果對(duì)于上面我說(shuō)的“很顯然“你一時(shí)顯然不起來(lái)的話(huà)，我可以幫你舉這樣的一個(gè)例子：你把溶度未知的DNA溶液稀釋100倍(即稀釋到10-2稀釋度)后取 0.080ml去測(cè)0D值結(jié)果發(fā)現(xiàn)這0.08ml的稀釋液含有1個(gè)ug的DNA，那么很顯然可以知道如果直接取0.080ml的原液就應(yīng)該含有100ug 的DNA，該DNA 溶液的溶度為100ug/0.080ml=1250ug/ml。如果你還很顯然不起來(lái)的話(huà)，建議你不要從事和理工科相關(guān)的工作，你可去當(dāng)總統(tǒng)什么的，千萬(wàn)別當(dāng)財(cái)政部部長(zhǎng)！說(shuō)明：我們已經(jīng)證實(shí)，TCID50法測(cè)到的滴度d=log10值比標(biāo)準(zhǔn)空斑法高0.7。將TCID50/ml轉(zhuǎn)換為PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml4×107 PFU/ml。兩次重復(fù)試驗(yàn)得到的滴度值應(yīng)相差0.7個(gè)log1