1、煙草葉片的組織培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)通過(guò)配制3種不同的培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)煙草種子苗葉片誘導(dǎo)、分化及植 株再生從而深刻理解植物細(xì)胞的全能性、學(xué)習(xí)和掌握植物組織培養(yǎng)技術(shù)，二、實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)是從20世紀(jì)30年代初期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物技術(shù)。由于其 擁有占地少、繁殖系數(shù)大等特點(diǎn)，現(xiàn)以在全世界的園林植物尤其是花卉的種苗 繁育上得到廣泛應(yīng)用。本文著重介紹組織培養(yǎng)技術(shù)的理論原理、操作過(guò)程、生 產(chǎn)技術(shù)以及經(jīng)濟(jì)核算等方面的內(nèi)容，使大家對(duì)組織培養(yǎng)在園林植物尤其是花卉 的種苗繁育的應(yīng)用有所了解，為以后的實(shí)際操作提供依據(jù)。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標(biāo)是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個(gè)離 體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)

2、胞，通過(guò)脫分化形成愈傷組織，并由愈傷 組織再分化形成植物體。從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè) 時(shí)期：起動(dòng)期、分裂期和形成期。培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)是組培法育苗中的關(guān)鍵步驟。根據(jù)理論與實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，對(duì)不 同種類的花卉及不同的取材部位，需設(shè)計(jì)出相適應(yīng)的配方，并從中篩選出最佳 者。繼代芽增殖培養(yǎng)：很多花卉植物經(jīng)過(guò) 2-6周的培養(yǎng)即可分化出大量的不定母液濃縮母液配制1升芽。根據(jù)情況可以將這些增殖了大量新芽的外植體重新分割進(jìn)行幾代培養(yǎng)，以擴(kuò)大繁殖規(guī)模直至滿足繁殖需要為止。三、實(shí)驗(yàn)材料植物材料：煙草植株藥品：激素(2,4-D、NAA、6-BA濃度均可)、1N NaOH、1N HCl 蒸儲(chǔ)水、70%酒精、

3、0.01%升汞儀器：1玻璃杯、1玻璃棒、1pH試紙(5.5-9.0) 1瓶無(wú)菌水、1個(gè)無(wú)菌燒杯、1包無(wú)菌濾紙、1個(gè)無(wú)菌白瓷板、培養(yǎng)瓶若干 移液器、微波爐、滅菌器、超凈工作臺(tái)、酒精燈、 解剖刀、 銀子四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4.1 MS培養(yǎng)基母液的配制編種號(hào)類大KNO319001019000量NH4NO31650101650010001元MgSO4 7H2O370103700100素KH2PO41701017002CaCl2 2H2O4401044001000100MnSO4 4H2O22.31002230ZnSO4 7H2O8.61008603微H3BO36.2100620量KI0.83100831

4、00010元Na2MoO4 7H2O0.2510025素CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54鐵Na2-EDTA37.31003730100010鹽FeSO4.4H2O27.81002780甘氨酸2.01001005有鹽酸叱哆醇0.510025機(jī)鹽酸硫錢素0.1100550010物煙酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1 .大量元素按照使用時(shí)高10倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除CaC12 2H2O單獨(dú)配制外，其余化合物混合在 500ml燒杯中加適量蒸儲(chǔ)水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸儲(chǔ)水定

5、容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽注明化合物名稱（或編號(hào)），濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名，CaC12 2H2O配制同上置于另一小口瓶中。2 .微量元素母液的配制按要求濃縮 100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽（ FeSO 4 7H2O和Na2-EDTA.2H 2O）作為一組單獨(dú)配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸儲(chǔ)水溶解后， 定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。3 .鐵鹽配制將 FeSO 4 7H2O和Na2-EDTA.2H 2O分別溶于450ml蒸儲(chǔ)水中，加熱，（很重要）不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào) PH至5.5加水定容至1000ml ,置于小口瓶中，貼

6、 上標(biāo)簽。4 .有機(jī)物母液配制，按母液要求濃縮50倍，除蔗糖按 3%單獨(dú)臨時(shí)稱量外，其余分別稱量后，溶解，定容在 500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。5 .母液最好在24 c的冰箱中貯存，特別是有機(jī)類物質(zhì)，貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，無(wú)機(jī)鹽母液最好在一個(gè)月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。1 .制備母液和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，所用蒸儲(chǔ)水或無(wú)離子水必須符合標(biāo)準(zhǔn)要求，化學(xué)藥品必須 是高純度的（分析純）。2 .稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專用一藥匙。.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制：為了操作方便，節(jié)約時(shí)間，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制培養(yǎng)基時(shí)只要稍加計(jì)算，按需要量取即可。不

7、同藥品在配制時(shí)若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，泰乙酸（NAA）, 口引喋乙酸（IAA）,赤霉素（GA3）, 2, 4-D等生長(zhǎng)素和玉米素（ZT）可先用少量 95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加熱。激動(dòng)素（ KT）和6-茉基喋吟（BA）可溶于少量1mol/L的 鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。稱取50mg生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在 100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg ,配制后一般要求在低溫（04 C）保存，配制培養(yǎng)基時(shí)如每升（1000ml ）需添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時(shí)，則取1ml母液即可。4.2培養(yǎng)基配制和滅菌4.2.1 培養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序

8、本次實(shí)驗(yàn)使用（1）愈傷組織誘導(dǎo)及其幼芽分化培養(yǎng)基：MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L;（2）幼芽增殖培養(yǎng)基： MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L;（3）生根培養(yǎng)基:MS+NAA 0.2 mg/L。注意事項(xiàng)：上述培養(yǎng)基均在 MS固體培養(yǎng)基溶化后降低到50左右后，加入相應(yīng)激素所得，MS固體培養(yǎng)基的配置過(guò)程在此不作過(guò)多贅述上述培養(yǎng)基均附加3%蔗糖，0.8%瓊脂，pH5.8,培養(yǎng)溫度25及C,光照強(qiáng)20001X。（一）.母液吸取量的計(jì)算配制培養(yǎng)基的升數(shù)公式1 :母液吸取量=母液體積（CC） x母液濃縮倍數(shù)培養(yǎng)基要求的含量（各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）公式2

9、:母液吸取量=母液每CC的含量（二）各種母液按順序編號(hào)排列A.大量元素；B.CaCl 2.2H2O ; C.微量元素 ；D.鐵鹽； E.有機(jī)物；F.生長(zhǎng)素泰乙酸（NAA）:配制0.5mg/ml的NAA稱取50mg , NAA用少量95%酒精溶解后加蒸儲(chǔ)水定容至 1000ml ; G.細(xì)胞分裂素、激動(dòng)素（KT）配制0.5mg/ml的KT稱50mgKT用少量1N HCL溶解后，加蒸儲(chǔ)水定容至100ml。（三）配制培養(yǎng)基（1000ml ）1 .瓊脂：稱取57g瓊脂，加入300ml蒸儲(chǔ)水，加熱溶解直至完全溶解為止.2 .蔗糖3%用質(zhì)量較好的白糖代替，稱取 30g白糖，溶于溶有瓊脂的300ml蒸儲(chǔ)水中。

10、3 .各種母液的吸取（培養(yǎng)基 1L）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（ A）和CaCl 2 2H2O母液（B）各100ml（2） 分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（ C）,鐵鹽（D）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有機(jī)物（H） 10ml（4） 移取激素將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至80c左右，用酸度計(jì)或精密PH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的 PH 一般要求5.86.0 ,過(guò)酸過(guò)堿則用 1N NaoH和1N HCL 調(diào)整。二.分裝：用一個(gè)接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基分裝到 25-30個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶約 30ml左右（一般占試管、三

11、角瓶容量 1/41/3左右）注：培養(yǎng)基勿碰 瓶壁。三.包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標(biāo)明培養(yǎng)基代號(hào)即可進(jìn)行滅菌。用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過(guò)的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水洗滌干凈，然后按次序放回原處。4.2.2 養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌（高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法）具體操作步驟：1 .高壓鍋放水至平把架；2 .把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋 ；3 .蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽（注意對(duì)角擰緊螺帽）關(guān)上氣閥和安全閥.4 .然后接通電源.5 .壓力計(jì)升至0.05MPa時(shí)，打開(kāi)放氣閥，排除冷空氣（此步很重要）。6 .排除冷空氣后，關(guān)閉放氣閥，待壓力升到 0.11MPa位置時(shí)，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)

12、間， 具體方 法：當(dāng)壓力鍋指針升至 0.12MPa時(shí)，關(guān)閉電源，待指針下降至 0.11MPa時(shí)接通電源，不 斷重復(fù)此操作過(guò)程，維持 20分鐘。7 .滅菌時(shí)間達(dá)到 20分鐘后，除去電源，打開(kāi)放氣閥（注意要逐漸放氣）待高壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后，打開(kāi)熱壓滅菌鍋蓋 （注意對(duì)角扭松螺帽）稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。8 .經(jīng)過(guò)滅菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長(zhǎng)，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無(wú)微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25 c下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，可在4 c低溫下保存。滅菌高壓鍋有大型臥式、中型立式、小型手提式等多種型號(hào)和規(guī)格，無(wú)論哪種型號(hào)，操 作的步驟都很相近。進(jìn)水一放進(jìn)培養(yǎng)基一蓋緊鍋

13、蓋一關(guān)上放汽閥一檢查安全閥一接上加熱源一待壓力升至0.05MPa 時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥一0.11MPa（121 C）下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力一除熱源一逐漸打開(kāi)放氣閥一鍋內(nèi)空氣排除完后一開(kāi)放鍋蓋一稍冷后取出培養(yǎng)基。4.3植物材料表面滅菌消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng) 基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手 續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過(guò)程叫做接種。1.接種步驟：第一步：清理材料一一流水沖洗一一加入吐溫（或洗衣粉）清洗一一自來(lái)水沖洗第二步：對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌：70%酒精浸10-30秒一一無(wú)菌水

14、第三步：滅菌劑處理一一 0.1-1%升汞5-8 min （或其他滅菌劑）第四步：無(wú)菌水進(jìn)行沖洗注意事項(xiàng)：1 .滅菌劑一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用.升汞可以短期儲(chǔ)存.2 .對(duì)去除較容易的滅菌劑滅菌后無(wú)菌水沖洗3- 4次，升汞一般5 - 8次，每次不少于3min3 .滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底.4 .滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開(kāi)始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。5 .滅菌液要充分浸沒(méi)材料6 .無(wú)菌操作可按以下步驟進(jìn)行：(1)在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時(shí)打開(kāi)其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌；(2)在接種前20分鐘，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)

15、驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面；(5)先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鐐子和剪刀從頭至尾過(guò)火一遍，然后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；(6)接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鐐子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢?如葉片切成0.5cm 2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片葉原基)在接種過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(7)接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每 5天要大強(qiáng)度滅菌一次。4.4煙草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芬的分化

16、于超凈臺(tái)中徹底沖洗外植體；70%酒精消毒3min；無(wú)菌水沖洗3遍，每 遍3mini ;將煙草葉片殘留的水分用滅過(guò)菌的濾紙吸干；白瓷板上用消毒的 解剖刀分割為1-1.5cm2的小塊；接入相應(yīng)的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種4-5 塊。接入(1)中培養(yǎng)。約23d后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹；15d后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為 100% ;30d后，從葉片外植體產(chǎn)生的疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點(diǎn)；60d后，不僅從愈傷組織上分化出越來(lái)越多幼芽，芽誘導(dǎo)頻率 （芽數(shù)/塊愈 傷組織）為2535,而且還可觀察到，該愈傷組織較早分化產(chǎn)生的幼芽葉片 呈現(xiàn)不同程度白化（或缺綠）。

17、但此時(shí)若將此缺綠幼芽切下，轉(zhuǎn)接至不加 2,4-D的幼芽增殖培養(yǎng)基（2）上，35d后即可恢復(fù)正常，缺綠癥狀消失，并可不斷增殖，發(fā)育成綠色健 壯的小苗。4 .誘導(dǎo)生根及移栽取約34cm長(zhǎng)的無(wú)根小苗接種于生根培養(yǎng)基（3）中，約78d后，幾乎 所有外植體均從其基部產(chǎn)生白色幼根，根誘導(dǎo)頻率為35,部分在培養(yǎng)基表面的根具大量白色根毛。當(dāng)試管苗長(zhǎng)至 56cm高時(shí)，打開(kāi)瓶口，在散射光下放 置2d后取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基，種植于經(jīng)過(guò)消毒的珍珠巖、泥炭土和菜 國(guó)土等量混合的基質(zhì)中，成活率可達(dá) 95%以上。5 .數(shù)據(jù)記錄煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)情況Word資料編號(hào)每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率煙草葉片愈傷

18、組織誘導(dǎo)情況編號(hào)每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率煙草葉片愈傷組織再生植株情況編號(hào)分化率每個(gè)愈傷組織分化芽數(shù)分化情況染菌率煙草葉片誘導(dǎo)生根情況編號(hào)生根率生根情況再生植株分化根數(shù)染菌率五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、將觀察結(jié)果加以描述和統(tǒng)計(jì)；對(duì)出現(xiàn)誘導(dǎo)失敗和污染的情況要加以認(rèn)真分析，找到原因。2、繪圖或照片六、思考題1、外植體脫分化形成愈傷組織的過(guò)程中，哪些激素起作用?2、如果時(shí)間允許，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)下游誘導(dǎo)愈傷組織分化和再生植株的實(shí)驗(yàn)附錄1常用植物激素類別名 稱縮寫詞分子量使用濃度范圍母液配制說(shuō)明生長(zhǎng)素2, 4 二氯苯氧乙 酸2, 4-D221.00.001 10mg/L生長(zhǎng)素通 常用NaOH 溶 液滴至溶 解成溶 液。能溶于乙 醇IAA易被植 物細(xì)胞所氧 化。故培養(yǎng) 基中很少單 獨(dú)使用。a 奈乙酸NAA186.20.001 10mg/L口即噪一 3 一乙酸IAA175.20.001 10mg/L口引喋一3丁酸IBA203.20.001 10mg/L細(xì) 胞 分 裂6辛基氨基喋吟BA225.2分裂素通 常能溶于 稀NaOH , 含水乙醇 或稀鹽酸玉米素不耐 熱，不能高 壓滅菌。6糠基氨基喋吟KT