1、基因家族分析套路（一）近年來，測序價格的下降，導致越來越多的基因組完成了測序，在數據庫中形成了大量的可用資源。如何利用這些資源呢？今日我帶你生疏一下不測序也能發文章的思路-全基因組基因家族成員鑒定與分析（現在這一領域可是很熱奧）；一、基本分析內容n 數據庫檢索與成員鑒定n 進化樹構建n 保守domain和motif分析.n 基因結構分析.n 轉錄組或熒光定量表達分析.二、數據庫檢索與成員鑒定1、數據庫檢索1）首先了解數據庫用法，學會下載你要分析物種的基因組相關數據。一般也就是下面這些數據庫了n Brachypodiumdb:/n TAIR:h

2、ttp://n Rice Genome Annotation Project ：/.n Phytozome:n Ensemble:/genome_browser/index.html n NCBI基因組數據庫：/assembly/?term=2）已鑒定的家族成員獵取。      如何獲得其他物種已發表某個基

3、因家族的全部成員呢，最簡潔的就是下載該物種蛋白序列文件（可以從上述數據庫中下載），然后依據文章中的ID，找到對應成員。對于沒有全基因組鑒定的，可以下列數據庫中找：   a. NCBI: nucleotide and protein db.     b. EBI: http:/www.ebi.ac.uk/.     c. UniProtKB:/un

4、iprot/2、比對工具。一般使用blast和hmmer，具體使用命令如下：n Local BLASTformatdbi db.fasp F/T；blastallp blastp(orelse) i known.fasd db.fasm 8 b 2(or else) e 1e-5 o alignresult.txt.-b:output two different members in subjec

5、t sequences (db).n Hmmer (hidden Markov Model) search. Thesame as PSI-BLAST in function. It has a higher sensitivity, but the speed islower.Command:hmmbuild-informatafaknown.hmmalignknown.fa; 

6、60;hmmsearchknown.hmmdb.fas>align.out.3、過濾。n Identity: 至少50%.n Cover region: 也要超過50%或者蛋白結構域的長度.n domain: 必需要有完整的該蛋白家族的。工具pfamdb (http:/pfam.sanger.ac.uk/) 和NCBI Batch CD- search. (/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi).n EST 

7、支持n  Blast and Hmmer同時檢測到4、通過上述操作獲得某家族的全部成員基因家族分析套路（二）本次主要講解在基因家族分析類文章中，進化部分分析的內容。主要是進化樹的構建與分析。一、構建進化樹的基本步驟、多序列比對. Muscle program.、Model 選擇. 分別針對蛋白序列和核酸序列的模型選擇程序。ProtTest program for protein and ModelTest or Jmodetlest for

8、60;DNA(、算法選擇。三種. NJ, ML and BI.、軟件選擇。 MEGA (bootstrap least 1000 replicates), phyML and Mrbayes (、進化樹修飾. MEGA: view->options and subtree-> draw options. Also can be decorated 

9、;in word (二、具體步驟 2.1 多序列比對。一般接受muscle。由于 MUSCLE is one of the best-performing multiple alignment programs according to published benchmark tests, with accuracy and speed that are&#

10、160;consistently better than CLUSTALW.2.2 模型選擇。對于用蛋白序列構建進化樹的可以接受下面命令：   java  -Xmx250m  -classpath  path/ProtTest.jar  prottest.ProtTest  -i alignmfile.phy.運行結果如下圖 留意：1）“.Phy” format. Only a

11、llow ten charaters.留意名字不能重復相同。2）AIC: Akaike Information Criterion framework.3）Gamma distribution parameter (G): gamma shape.3）proportion of invariable sites: I. 2.3 構建進化樹2.3.1 意義：a聚類分析。如亞家族分類。像MAPKKK基因家族通過進化樹可以清楚分為&

12、#160;MEKK, Raf and ZIK三個亞家族.b親緣關系鑒定。在進化樹上位于同一支的往往示意這親緣關系很近c 基因家族復制分析。爭辯基因家族復制大事（duplication events），兩種復制大事類型常接受的標準：Tandem duplication: Identity and cover region more than 70% and tightly linked (Holub, 2001).&#

13、160;Chromosomal segment duplication: Plant Genome Duplication Database (PGDD: /duplication/)2.3.2 進化樹。一般ML樹比較精確，但應結合方法，如NJ樹，相互驗證。2.3.3 進化部分分析：KaKs計算 簡潔的方法. 可以使用下面的網頁PAL2NAL(http:/www.bork.embl.de/pal2nal/)2.

14、3.3.2 標準方法：.a. ParaAT: ParaAT.pl-h test.homologs -n test.cds -a test.pep -p proc f axt k -o outputb. KaKs_Calculator m NG(or else) -i test.axt -o test.axt.kaksc.分歧時間計算：Divergenttime（T）&

15、#160;calculation.    T=Ks/2.  : mean 5.1-7.1×10-9  .d. Ka/Ks意義：  Ka/Ks=1.中性進化。.  Ka/Ks<> Ka/Ks>1.正選擇。Positively selected genes and produce fitness advantagemutations to evolve 

16、new functions.基因家族分析套路（三）本節主要講基因結構分析套路1、Motif分析 使用軟件MEME，命令如下：  meme sample.fa -dna revcomp -nmotifs 10  -mod zoops -minw 6-maxw 50>meme_htmlFormat.html2、基因結構分布圖可以使用在線網站GSDS2.0：website:用法如下：結果呈現3、基因結構常見統計信息：自己excel或寫程序統計&#

17、160;  a. The number of intron andexon.   b. The splicing intronpattern inculding 0,1,2 phase.   c. The marked region. Forexample kinase domain.   d. sequen

18、ce length.   e. UTR.4、啟動子分析。網站：主要做植物的：http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/留意事項：a. IE brower.b. Only one sequence for oncesearch and the length was limited in 1000 bp.c. DNA&

19、#160;sequence origin: 1000 or1500 bp upstream of ATG of one gene.分析結果：基因家族分析套路（四）一、轉錄組及芯片原始數據下載網站  1、  GEO datesets/profile(/gds ).。用法見下圖。GEO數據ID命名規章：GPL->GSE->GSM.GPL: platformGSE:&#

20、160;multiple series.GSM: multiple samples.GDS  GSE. Thedifference concentrated on the data labeled GDS can be analyzed for one geneonline. It is simple and easily.The data in&

21、#160;the sameGPL can be used to  compare inexperiment下面是在線分析轉錄組數據的用法：2、EBI ArrayExpress(http:/www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) 該數據庫下載數據用法如下：3、PLEXdb(/).該數據庫下載數據用法如下，留意用戶名和密碼！4、SRA db(/sra/)5、DRA db（

22、http:/trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/）二、數據處理 拿到原始數據，要進行處理，才能進行后續數據分析。1、芯片數據。原始數據格式“.cel”格式。以AffyMicroarray數據處理為例敘述主要的命令如下：> library(affy); >library(makecdfenv);  >library> barleyGenome = make.cdf.env(“barleyGenome.cdf")>mydata <-

23、60;ReadAffy() #choose “.cel “ file analyzed.>eset <- rma(mydata);>write.exprs(eset,file="mydata.txt")>design <- model.matrix(-1+factor(c(1,1,2,2,3,3) # Createsappropriate design matrix. >colnames(design

24、) <-c("group1", "group2", "group3") # Assigns column names.>fit <- lmFit(eset, design) # Fits a linear model for each gene based onthe given series

25、0;of arrays.>contrast.matrix <- makeContrasts(group2-group1,group3-group2, group3-group1, levels=design) # Creates appropriate contrast matrix toperform all pairwise comparisons.>fit2 <- contrasts.fit(fit,

26、60;contrast.matrix)# Computes estimatedcoefficients and standard errors for a given set of contrasts.>fit2 <- eBayes(fit2) # Computes moderated t-statistics and log-oddsof differential expr

27、ession by empirical Bayes >topTable(fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=10) # Generates list of top 10 ('number=10')differentially expressed genes sorted by B-valu

28、es ('sort.by=B') for firstcomparison group.>write.table(topTable(fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=500),file="limma_complete.xls", s=F, sep="t") # Exports complete limma statistics table forfirst comparison group.>results <-&