1、單克隆抗體多克隆抗體制備班級：03生技6 學(xué)號： 姓名：應(yīng)堯 指導(dǎo)師：鄭蔚紅摘要 單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具,在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面有著不可或缺的作用。本文全面綜述了單克隆抗體研究最新進展。通過構(gòu)建真核表達載體,采用DNA 免疫、細胞免疫、消減免疫和多位點重復(fù)免疫等現(xiàn)代分子免疫學(xué)方法,快速制備高親合力的單克隆抗體,改進常規(guī)方法制備單抗費時費力且親合力低的弱點,對后基因時代蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的研究具有巨大的推動作用;同時在生物芯片、臨床醫(yī)學(xué)和疾病的診斷與治療以及空間生命科學(xué)等應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞多克隆抗體, 單克隆抗體單克隆抗體指來自一個B淋巴細胞

2、的單克隆雜交瘤細胞株所分泌的、針對同一抗原決定簇的抗體。1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和法國科學(xué)家柯勒開創(chuàng)了將產(chǎn)生抗體的單個細胞（如B淋巴細胞）和瘤細胞（如骨髓瘤細胞）雜交的技術(shù)，形成雜交瘤細胞，成功地獲得了化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的單克隆抗體，并因此獲得1984年的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。1 半抗原載體復(fù)合物有多種結(jié)合位點,免疫系統(tǒng)將會產(chǎn)生具有不同特異性的多種抗體(稱為多克隆抗體).多克隆抗體包含不同種類的抗體,所以在免疫檢測使用之前抗體必須標準化。2單克隆抗體的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，合成場所是核糖體，它是由基因控制合成的，合成過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個重要步驟。B淋巴細胞中產(chǎn)生抗體的基因轉(zhuǎn)移到了雜交瘤

3、細胞的DNA中，抗體基因在雜交瘤細胞中指揮抗體合成。雜交瘤細胞以有絲分裂的方式大量增殖，所以在雜交瘤細胞的培養(yǎng)過程中，需要定期地用胰蛋白酶處理，然后分裝到更多的培養(yǎng)基中。單克隆抗體具有免疫作用，它與血清抗體相比，優(yōu)越之處在于特異性強、靈敏度高、產(chǎn)量高。 1 單克隆抗體制備1.1單克隆抗體技術(shù)的基本原理小鼠骨髓瘤細胞能在體內(nèi)外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白,而免疫小鼠脾細胞具有產(chǎn)生抗體的能力,但不能無限增殖。采用融合劑(PEG等) 將這兩種細胞融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有親代細胞的主要特征。既能在人工培養(yǎng)下無限增殖,又能產(chǎn)生特異性抗體。可通過有限稀釋法選育由單個細胞增殖而成的克隆。

4、31.2 單克隆抗體技術(shù)的基本的過程包括給小鼠注射一種抗原，它可以被免疫系統(tǒng)識別，因此誘導(dǎo)小鼠的B淋巴細胞產(chǎn)生相應(yīng)抗體。然后，在培養(yǎng)基中融合小鼠的B 淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞，產(chǎn)生雜交瘤細胞，經(jīng)過篩選分離出單個雜交瘤細胞，再使單個雜交瘤細胞擴增，最后分離、純化抗體。但這種方法產(chǎn)生的是純粹的小鼠單克隆抗體，它使患者產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。為了克服鼠源性抗體的免疫排斥反應(yīng)，科學(xué)家研究各種各樣的技術(shù)使小鼠的抗體人源化。一種方法是用人的組分取代小鼠單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)以外的部分。另外一種方案稱為抗體的人源化，即利用遺傳工程的方法，用人源蛋白盡可能多地、有選擇地取代小鼠抗體，包括大部分抗原結(jié)合區(qū)。經(jīng)過長達25

5、 年的努力后，研究者最終把人類B 細胞與骨髓瘤細胞融合，形成的雜交瘤細胞可以產(chǎn)生完全人源化的抗體。它使單克隆抗體更接近商品化。也有一些公司轉(zhuǎn)向研究轉(zhuǎn)基因動物和植物，即通過物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，將編碼人源性蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)入實驗動物（如鼠、羊、牛等）的受精卵中，再將受精卵植入動物子宮，最后培育出可以表達目的蛋白或多肽的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物在它們的乳汁中分泌單克隆抗體，如表達人胰島素的轉(zhuǎn)基因羊或牛，這些羊或牛的奶中就含有人的胰島素，這樣，一只羊或一頭牛就是一個生物發(fā)生器，通過喂養(yǎng)飼料（草）就可以生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本，具有巨大的商業(yè)價值。但這類產(chǎn)品還沒有得到FDA 認證，此外從乳汁的

6、蛋白中分離單克隆抗體需要經(jīng)過煩瑣的步驟，并且遺傳學(xué)方法改造以及喂養(yǎng)這些動物還需要花費很多年。傳統(tǒng)制備單克隆抗體的方法需要融合細胞雜交瘤細胞1.將抗原注射到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生針對該抗原的抗體。2.a. 從脾臟中分離各種B 淋巴細胞（可以產(chǎn)生抗體的細胞）。2.b. 從骨髓瘤（一種骨髓癌）中獲得可以無限繁殖的骨髓瘤細胞。3.融合的細胞形成雜交瘤細胞，未融合的細胞則死亡。4.分離雜交瘤細胞，并在培養(yǎng)基中進行分裂增殖。5.挑選可以與初始抗原結(jié)合的雜交瘤細胞。6.在實驗室或小鼠腹腔中使雜交瘤細胞增殖。7.從培養(yǎng)基或小鼠腹水中純化抗體。噬菌體感染細菌的病毒，可以替代雜交瘤細胞1.將編碼與抗原結(jié)合的各種抗體片段的

7、基因插入細菌細胞，再用噬菌體感染細胞。2.被噬菌體感染的細菌產(chǎn)生新的噬菌體，每個噬菌體的一端攜帶一個不同的抗體片段。3.從噬菌體混合物中，篩選出攜帶抗體片段的噬菌體，這些抗體片段僅與目的抗原特異結(jié)合。重復(fù)上述過程2-3次。4.將篩選出的噬菌體基因放回細菌中，制備大量、特異的抗體片段。5.將抗體片段拼接在抗體骨架上，制備完整抗體。1.3 單克隆抗體優(yōu)點單克隆抗體有很多優(yōu)點,如:高度的單一性和均一性;高效價;免疫抗原不需提純,但可獲得純抗體;可獲得不同特異性(組、型、株) 的單克隆抗體 ;產(chǎn)量高,可連續(xù)生產(chǎn)等。這些優(yōu)點中,尤其是均一的高特異性,使單克隆抗體有著極廣泛的實用價值,在世界上已形成頗為熱

8、門的新興產(chǎn)業(yè)。2多克隆抗體制備用提純病毒液免疫大耳白兔, 第一次耳靜脈注射013mg , 以后為肌肉內(nèi)多點注射, 每兩周注射1次, 每次015mg , 用等體積弗氏不完全佐劑(Sigma) 乳化, 共免疫3 次, 末次注射2 周后從耳靜脈取血測定抗血清效價。傳統(tǒng)制備大量抗體的方法主要有2 種,一種方法是直接免疫大型動物(如兔、山羊等) 后獲取抗血清,該方法制備的為多克隆抗體,具有免疫用抗原需要量高、免疫周期長、購買和飼養(yǎng)大動物成本較高等局限性;第2 種方法是采用雜交瘤技術(shù)8篩選獲得雜交瘤細胞株后,用癌細胞誘發(fā)腹水的方法來獲得大量的單克隆抗體. 目前應(yīng)用最為廣泛的主要是鼠源性的單克隆抗體,該方法

9、制備細胞株時間比較長,需經(jīng)常凍存和復(fù)蘇細胞株,對實驗條件、無菌操作等要求較高,并有細胞株分泌抗體能力丟失的風險. 特異性的抗體制備是很多實驗室經(jīng)常要做的一項工作,采用有限的抗原免疫成本低、容易飼養(yǎng)的小鼠,經(jīng)濟高效地獲得特異性的抗體是科技人員的理想選擇. 我們以人絨毛膜促性腺激素和人免疫球蛋白作為抗原,通過小劑量、多次免疫Balb/ c鼠,于免疫鼠腹腔內(nèi)注射石蠟油和NS - 1 骨髓瘤細胞刺激產(chǎn)生腹水的方法,獲得了大量高效價的抗hCG和抗人免疫球蛋白的鼠源性多克隆腹水抗體,為研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ).3 單克隆抗體的應(yīng)用價值分析3.1 細菌學(xué)方面的作用利用單克隆抗體鑒定和分離微生物成分,有助于研制新

10、疫苗,改進現(xiàn)有疫苗。例如:研制出副作用少的破傷風多肽菌苗。3. 2 病毒學(xué)方面的作用人類對于由流感病毒抗原性突變產(chǎn)生的病毒突變株缺乏免疫力,往往在其抗原性突變時引起世界性流行。風流感病毒血凝素抗原的單克隆抗體,已檢出以前不能檢出的毒株之間的差異。這樣就能及時監(jiān)測病毒的抗原變化,遏制流感的世界性流行 。43. 3 傳染病學(xué)方面的作用3.3.1 傳染病的診斷將單克隆抗體制成特異性的診斷試劑盒,能夠早期、快速、準確地用于乙型肝炎、流行性出血熱,風疹病毒等傳染病的診斷。如我國制備的乙型肝炎血凝試驗診斷試劑盒達到世界衛(wèi)生組織認可的標準。3.3.2 傳染病的治療用細胞工程產(chǎn)生的單克隆抗體,著重調(diào)節(jié)機體的免

11、疫功能而較少副作用,因而在多種疾病的治療上,具有傳統(tǒng)藥物所不可替代的作用。如單克隆抗體可取代高效價的人免疫球蛋白制劑,作為抗生素的輔助治療,降低某些傳染病的發(fā)病率和死亡率。在我國用單克隆抗體技術(shù)治療乙型腦炎獲得突破,已用于乙腦的臨床治療。這在國內(nèi)外尚屬首次。3.4腫瘤學(xué)方面的作用3.4.1 有助于研究腫瘤的發(fā)生機制如蛋白激酶C(PKC) 于1971 年被發(fā)現(xiàn)以來,在生命活動中日益顯示出它的重要性,不僅在生命信號系統(tǒng)中起重要作用,而且是腫瘤促進劑佛波脂的細胞內(nèi)受體,與腫瘤發(fā)生有著密切的關(guān)系。PKC 單抗的制備,可有助于探討PKC 在細胞增殖和轉(zhuǎn)化中的作用。53.4.2 腫瘤診斷用同位素標記單克隆

12、抗體,可追蹤尋找體內(nèi)的特異性抗原。如檢查腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移或擴散;也能制造出具有特殊選擇性的單克隆抗體 ,在癌癥早期無癥狀時獲得診斷,而這時,癌癥大多是可以治愈的。3.4.3 腫瘤的治療單克隆抗體還用于治療腫瘤,一種是直接治療法。第二種是將單抗作為載體,與抗癌藥物如:放射性核素、毒素、化療藥物等交聯(lián),制成“生物導(dǎo)彈”,直接達到腫瘤內(nèi),殺死癌細胞。這樣還可減少對正常細胞的殺傷。這種腫瘤生物療法有可能成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療方法。6例如:用人的抗體GM2 單抗局部注射治療惡性黑色素瘤已取得較好療效。最近有報道:美國科學(xué)家以單抗為基礎(chǔ)制成的“RITUXAN”,用于治療非何杰金氏淋巴癌,

13、這種治癌新藥與化療不同,不會傷害癌變病灶周圍其他種類的細胞。3.5 移植免疫學(xué)方面的應(yīng)用應(yīng)用抗T 細胞,抗IL - 2R 的單克隆抗體可防治器官移植排斥反應(yīng),目前已用于腎移植患者,可延長移植物的存活時間。此外,在生殖免疫學(xué)方面,單抗還是尋找精子抗原研究精子表面大分子的結(jié)構(gòu)與功能的最重要的分子探針。迄今為止,人們用單抗已找到不少人和動物的精子抗原。因為精子必須經(jīng)過獲能(CA) 和頂體反應(yīng)(AR) 才具有受精能力,故利用單抗研究CA 和AR 前后精子細胞內(nèi)和細胞表面大分子的變化,可探索新的避孕方法和男性不育診斷及治療的新途徑。3.6單克隆抗體幫助學(xué)習(xí)科學(xué)家已為將來開發(fā)一種能增強學(xué)習(xí)效果的藥物打下基

14、礎(chǔ)。有認知困難,反應(yīng)遲鈍的人將可以接受一種以單抗B6B21 為基礎(chǔ)出來的藥物的治療。這種單抗能與大腦的某些受體結(jié)合,將其注射到家兔體內(nèi)后,這些家兔在完成簡單任務(wù)的時候,速度提高了一倍。3.7生物工藝學(xué)方面的應(yīng)用制成能與特殊細胞反應(yīng)的單抗,應(yīng)用于細胞分離。再如:使用能表達人類淋巴細胞表面抗原的昆蟲細胞制備的單抗,不激發(fā)針對人類細胞的免疫反應(yīng),故可使用源于人的建株細胞進行單抗的篩選,可大大減化篩選過程。3.8基因工程方面的應(yīng)用鼠源單抗用于治療有一定的困難,一個替代方法是用DNA 重組技術(shù)創(chuàng)造人鼠嵌合體,這樣構(gòu)造的抗體既保持了鼠單抗的特異性和親和力,又大大減少了在人體內(nèi)的免疫原性。如抗胃癌、抗小細胞

15、肺癌的嵌合抗體已制備出來,抗乙腦病毒單抗輕鏈可變區(qū)基因的被分離和鑒別。7此外,單抗還用于基因目的產(chǎn)物的提純后處理工藝。3.9基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用對抗原的深入研究。分析細胞表面抗原及形態(tài)。血中T 淋巴細胞亞類的鑒定。分析病原菌抗原。抗體結(jié)構(gòu)和功能的進一步研究。鑒定微生物。由此可見,單抗技術(shù)已深入到醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的各個領(lǐng)域,成為一種必不可少的工具,具有極為重要的理論研究價值和實用價值。目前,單抗技術(shù)已基本完善,大量的單抗已應(yīng)用各個領(lǐng)域。當前的研究重點是制備、應(yīng)用新的單抗,擴大已有單抗的應(yīng)用范圍,特別是臨床治療的單抗和導(dǎo)向藥物,尚有較大潛力。4 單克隆抗體研究新進展4.1 DNA 免疫DNA 免疫,也叫

16、基因免疫。1990 年Wolf 等發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉直接注射純化的DNA 或RNA 重組表達載體,可使載體上的基因在局部肌細胞內(nèi)表達持續(xù)數(shù)月甚至終身,而且沒有檢出外源核酸與宿主染色體整合。這一發(fā)現(xiàn)打開了通往一種新的免疫途徑的大門。由于不加任何佐劑或載體,故又稱為裸DNA 免疫。以遺傳物質(zhì)方式直接進入機體的DNA 免疫與傳統(tǒng)的蛋白免疫及用基因工程技術(shù)制備的純化蛋白免疫相比有很多優(yōu)點:該技術(shù)是將編碼目的抗原或病原體的質(zhì)粒DNA 接種于宿主體內(nèi)或細胞內(nèi)。這些目的抗原或病原體在胞內(nèi)合成,產(chǎn)生可直接與類或類MHC 分子結(jié)合的抗原肽以呈遞抗原,激起機體廣泛的免疫反應(yīng),使機體對質(zhì)粒所編碼的抗原產(chǎn)生強烈而持久的細胞

17、和體液免疫應(yīng)答。用含開放讀碼框和合適真核轉(zhuǎn)錄翻譯控制信號的質(zhì)粒DNA 免疫,可誘發(fā)機體合成構(gòu)象及翻譯后加工形式與天然結(jié)構(gòu)相同的蛋白。內(nèi)源蛋白的合成類似病毒的感染,可以以類途徑呈遞外源蛋白,而專職APC 攝入可溶蛋白,可以以類途徑呈遞蛋白。因此免疫反應(yīng)的兩條途徑都被激活。此外,DNA 免疫不會引起由活病原體感染引起的細胞死亡及炎癥等組織變化。各種因素影響著DNA 免疫后基因的表達,包括使用的質(zhì)粒、給藥方式及器具。目前使用的質(zhì)粒通常含來自人巨細胞病毒、SV40 病毒及- 肌動蛋白的極早期啟動子,它們可以在許多類細胞中引發(fā)高水平的基因表達。最近對DNA 表達載體的改進包括增加內(nèi)含子和有效的轉(zhuǎn)運終止/

18、 加工單元、修飾載體增強抗原表達、改良物理轉(zhuǎn)運方法9,10和佐劑的使用11 。 Briones M1213 等用可生物降解和相容的聚合物制備吸附質(zhì)粒的陽離子微粒,通過改變微粒上DNA 的載荷,同時轉(zhuǎn)運幾種質(zhì)粒增強免疫反應(yīng)。增強DNA 反應(yīng)性的方法包括增加DNA 的穩(wěn)定性,增加DNA 在被注射組織中的分散性,以及共表達共刺激因子(如B27. 1 、B27. 2 和CD40) 1415 ,增加抗原的呈遞或共刺激作用,或者通過共表達細胞因子、免疫刺激因子(如IL22 、IL27 、IL210 、IL218 或GM2CSF) 增強免疫反應(yīng)16 。IL212 在先天性和獲得性免疫中起主要作用,它可誘導(dǎo)靜

19、息和激活的T 細胞以及N K 細胞產(chǎn)生大量的IFN2,因此常作為佐劑增強DNA 的反應(yīng)性;但Chen17等的研究卻證實IL212 表達質(zhì)粒抑制一種日本腦炎病毒DNA 疫苗的保護性免疫反應(yīng)。另一個途徑是使用雙順反子載體,裝載抗原和免疫反應(yīng)增強子的基因。DNA 免疫也可以用來產(chǎn)生針對非病毒病原體的抗體。通過肌肉注射質(zhì)粒DNA ,已經(jīng)成功地產(chǎn)生了針對一種原生動物寄生蟲(Schistosoma japon2icum) ,原生生物(Leishmania major 和Plasmodiumjoelii ) , 細菌( Mycobacterium tuberculosis ) 和Salmonella typ

20、hi ,Mycoplasma pulmonis 的抗體反應(yīng)。Tang 等的研究表明用含外源基因的真核表達載體免疫動物,能有效刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答,該技術(shù)已被成功地應(yīng)用于單抗的制備,Barry 等用此方法成功制備了高親合力的抗人生長激素單克隆抗體,能結(jié)合天然的生長激素。目前, 運用DNA 免疫的方法, 已成功制備了生長激素、flt318 、凝血因子IX、INF219和血型抗原20等,病原微生物如:prion、Helicobacter pylori 和HIV ,膜分子G- 蛋白偶連受體等的單克隆抗體。最近Li20等采用肌肉組織特異性的啟動子來進一步提高DNA 免疫的效果,其基本思想是構(gòu)建含肌肉

21、組織特異啟動子DNA 免疫載體,使抗體的親合力增加了10 倍。因此,在目的基因前加上肌肉組織特異的啟動子或改構(gòu)表達載體上的調(diào)控序列,可提高DNA 免疫抗體的親合力。DNA 免疫制備單克隆抗體除了上述優(yōu)點外,由于基因操作簡單,對免疫原性較弱的蛋白,通過與免疫原性較強的蛋白構(gòu)建融合基因載體進行免疫,如HIV 的外殼基因Env 和補體成分C3d DNA疫苗表達融合蛋白可增強HIV 外殼蛋白抗體的親合力成熟21 ;同時也可以構(gòu)建含有多種蛋白的融合基因載體進行免疫,產(chǎn)生針對不同蛋白的單克隆抗體。因此,DNA 免疫的研究日益引起學(xué)者們的關(guān)注,且得到越來越廣泛的應(yīng)用22 。 1 雍占高.何謂單克隆抗體J.

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