1、超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究摘 要： 采用超聲-酶-堿法從啤酒廢酵母中提取 -1,3-葡聚糖，在超聲波預處理和酶解最佳條件的同時，利用響應曲面法研究分析 NaOH 濃度、溫度、用量和時間對 -1,3-葡聚糖得率、純度和蛋白質含量的影響。試驗結果表明，超聲波處理后破壁率為 94.22 %；酶解后蛋白質去除率為 62.82 %；當加入 2.05 %的 NaOH 30.50 mL，74 處理5.7 h，-1,3-葡聚糖的得率為 10.21 %，純度為 88.14 %，蛋白質含量為 1.19 %。超聲-酶-堿法處理工藝具有 -1,3-葡聚糖得率、純度高、蛋白質含量低及提取時間短

2、的特點。關鍵詞： 綜合利用； 超聲-酶-堿法； 啤酒廢酵母； -1,3-葡聚糖； 響應曲面法Resarch on the Extraction of -1,3-glucan from WasteBeer Barm by Ultrasonic-enzyme-alkali MethodAbstract: -1,3-glucan was extracted from waste beer barm by ultrasonic-enzyme-alkali method. In addition to the research on the optimumconditions of ultrasound

3、 pretreatment and zymolysis, the effects of NaOH concentration, temperature, use level and reaction time on the yield,the purity and protein content of -1,3-glucan were studied by response surface method. The results showed that the broken rate of barm cells byultrasound was 94.22 %, the removal rat

4、e of protein after zymolysis was 62.82 %, when 30.50 mL 2.05 % NaOH was added for 5.7 h treatmentat 74 , the yield of -1,3-glucan was 10.21 %, the purity was 88.14 % and protein content was 1.19 %. The ultrasonic-enzyme-alkali methodhad the advantages including high -1,3-glucan yield and high purity

5、, low protein content as well as short extracition time.Key words: comprehensive utilization; ultrasonic-enzyme-alkali method; waste beer barm; -1,3-glucan; response surface method酵母 -1,3-葡聚糖是一種良好的生物效應調節劑BRMS， 在增強機體抗輻射和促進傷口愈合等方面有顯著作用1。 酵母 -1,3-葡聚糖除因不溶性使其在抗腫瘤等臨床應用上受到限制外，抗氧化、保濕、無刺激和免疫調節等特點，使其在食品、化妝品和醫

6、學方面有廣泛應用23。 據統計，2007 年中國啤酒產量為 3931.4 萬 t，產生廢酵母約 58.97 萬 t（干重），而 -1,3-葡聚糖含量達到酵母細胞壁的 29 %，開發潛力巨大。 目前，提取 -1,3-葡聚糖的方法主要有酸-堿法、酶-堿法和自溶-酶-堿法45。 其中，酸-堿法對環境污染嚴重，酶-堿法試劑用量較大，而自溶-酶-堿法雖能得到得率和純度較高的-1,3-葡聚糖，但提取時間過長。本文主要研究的是超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母-1,3-葡聚糖工藝，即在常規的酶-堿法之前，對酵母進行了超聲波預處理，使細胞壁松散、破碎，增大溶劑作用面積，以縮短提取時間和提高提取率。 首先對超聲波破壁

7、和酶解除蛋白效果進行研究，再采用響應曲面法優化堿溶條件（NaOH 濃度、溫度、用量和時間），建立堿溶與-1,3-葡聚糖之間的數學模型，以期獲得最優的工藝參數，為啤酒廢酵母綜合利用提供理論數據。1 材料與方法1.1 材料與儀器實驗材料：新鮮啤酒廢酵母（廣西南寧青島啤酒有限公司提供）；木瓜蛋白酶（食品級）；NaOH、無水乙醇等（分析純）。實驗儀器：丹麥 FOSS 自動定氮儀；美國貝克曼超速離心機；日本島津 UV-2051PC 紫外可見分光光度計；96真空冷凍干燥機。1.2 提取 -1,3-葡聚糖工藝流程啤酒廢酵母預處理超聲波處理酶解堿溶醇洗、水洗真空冷凍干燥-1,3-葡聚糖1.3 工藝要點1.3.

8、1 預處理新鮮啤酒廢酵母置于 0 冷水中絮凝， 回收啤酒（上清液）后過 200 目標準篩，制得水分含量為 20 %25 %的凈酵母，40 烘箱鼓風干燥后磨粉，待用。1.3.2 超聲波處理取干酵母 5 g，加入 15 mL 水，在功率為 140 W、頻率為 42 kHz 的條件下，處理 1080 min，再加入同體積的無水乙醇于 70 恒溫提取， 離心后測定上清液海藻糖和蛋白質含量。1.3.3 酶解取破壁后的酵母殘渣 5 g，先加入 50 mL 水，再添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，于 50 、pH6.0 條件下酶解8 h，離心后測定沉淀蛋白質含量。1.4 堿溶響應曲面優化試驗采用 Box

9、-Behnken 設計，選取 NaOH 濃度（x1）、溫度（x2）、用量（x3）和時間（x4）4 個因素為自變量，以 -葡聚糖的純度（Y1）、 蛋白質含量 （Y2） 和得率 （Y3） 為響應值。按照方程 xi=（Xi-Xo）/X 對自變量進行編碼。 式中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，X 為變量的變化步長。 試驗因素的水平編碼見表 1。設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：Y=+4i = 1iXi+4i=1,jiXiXj+4i = 1iiX2ij其中： 為常數項，i為線性系數，ij為交叉項系數，ii為二次項系數。1.5 分析方法用 FOSS

10、 自動定氮儀測定蛋白質含量， 蒽酮-硫酸法測定多糖含量6。得率 =成品質量原料質量×100 %純度 =多糖質量成品質量×100 %2 結果與分析2.1 超聲波處理超聲波主要通過空化效應， 使液體中產生空化泡，空化泡長到一定程度或強烈震蕩將發生崩潰，會在局部小區域內產生高溫高壓， 形成微射流及高速剪切力，使細胞壁破裂，內容物瀉出。 海藻糖和蛋白質作為細胞內主要內容物，能用來評價超聲波破壁的效果。 試驗結果見圖 1。由圖 1 可知，海藻糖提取率和蛋白質含量隨著超聲輔助提取時間的加長而迅速上升， 到 60 min 后達到穩定， 海藻糖最大提取率和蛋白質含量分別達到 94.22 %

11、和 5.27 %，說明超聲波處理達到了破壁的目的。2.2 酶解試驗蛋白酶能夠去除酵母殘渣中大量的蛋白質，為后續提純分離 -1,3-葡聚糖奠定基礎；同時，可以回收營養豐富的氨基酸、多肽蛋白液，提高酵母綜合利用水平。 研究表明，取破壁后的酵母殘渣 5 g，加入 50 mL 水，添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 條件下酶解8 h，蛋白質去除率達到最大值 62.82 %，且回收到 0.348g/L 的蛋白液。2.3 堿溶響應曲面優化試驗2.3.1 試驗結果影響 -1,3-葡聚糖品質的指標有純度、蛋白質含量和得率，結果見表 2。從表 2 可以知道， 純度的變化范圍為 60.2

12、7 %90.40 %，蛋白質含量變化范圍為 1.15 %2.99 %，得率變化范圍為 8.98 %12.10 %， 其中純度變化趨勢較明顯。2.3.2 方差分析用統計軟件 SAS9.1.3 對表 2 中的數據進行方差分析，結果見表 3表 6。 回歸參數方差分析和回歸模型誤差分析主要用來判斷所得方程是否能預測相關指標走向，并分析各因素對目標指標的影響。由表 3表 4 可知，Y1，Y2和 Y3回歸方程的一次項、Y1的二次項以及失擬項顯著性檢驗都是極其顯著的（P0.01）。 Y2的二次項是顯著的 （0.01P0.05），但Y3的二次項不顯著（P0.05）。 Y1的模型檢驗極顯著，擬 合 系 數 R2

13、為 0.9347；Y2的 模 型 檢 驗 顯 著 ，R2為1 0 1NaOH (%) x1X11.5 2 2.5x2X260 70 80NaOH (mL) x3X330 45 60(h) x4X45 6 7圖 1 超聲波處理時間對酵母破壁的影響馬 森，盧家炯,高俊永，初蘭娜，杜林繁·超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究97釀酒科技 2009 年第 2 期（總第 176 期）·LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY 2009 No2(Tol176)0.8123，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，適合分析-1,3-葡聚糖純度和蛋白質含量。

14、 而 Y3模型檢驗為不顯著，且 R2為 0.7038，不適合分析得率。響應曲面的因素方差分析和參數估計與顯著性分析主要用來評價獨立變量對響應值的影響，以及各變量系數對響應值的影響程度，從而得出主要影響因素。由表 5 可知，濃度和溫度對純度和蛋白質含量影響極其顯著，但對得率不顯著，而用量和時間對這 3 個指標影響均不顯著。由表 6 可知，對于純度，常數項、溫度的一、二次項系數以及時間的二次項系數極其顯著，濃度的一次項系數顯著，二次項系數極其顯著，其他均不顯著；對于蛋白質含量，常數項、濃度的一次項、溫度的一、二次項系數是極其顯著的，濃度的二次項系數是顯著的，其他均不顯著；對于得率，僅有常數項、濃度

15、和處理溫度的一次項ß X1X2X3X4Y1Y2Y31 -1 -1 0 0 62.31 2.34 12.102 -1 1 0 0 71.93 2.10 11.873 1 -1 0 0 70.15 2.24 10.114 1 1 0 0 81.21 1.73 9.035 0 0 -1 -1 90.40 1.26 11.006 0 0 -1 1 84.47 1.38 10.587 0 0 1 -1 82.35 1.23 10.138 0 0 1 1 81.33 1.21 10.019 0 0 0 0 88.42 1.23 10.3110 -1 0 0 -1 77.30 2.64 10.42

16、11 -1 0 0 1 74.99 2.23 10.3212 1 0 0 -1 82.09 1.28 10.0513 1 0 0 1 79.25 1.15 10.1014 0 -1 -1 0 66.60 2.01 10.8815 0 -1 1 0 70.37 2.99 10.1516 0 1 -1 0 83.78 1.22 9.5517 0 1 1 0 80.52 1.21 8.9818 0 0 0 0 88.62 1.23 10.3119 -1 0 -1 0 80.80 2.69 10.6520 -1 0 1 0 78.25 2.34 10.4221 1 0 -1 0 80.02 1.22

17、10.2622 1 0 1 0 83.46 1.19 9.4623 0 -1 0 -1 61.15 2.33 11.3124 0 -1 0 1 60.27 2.23 11.5125 0 1 0 -1 81.44 1.93 10.1226 0 1 0 1 80.48 1.15 9.9127 0 0 0 0 88.60 1.23 10.31R2P4 755.045 0.4132 <0.00014 925.022 0.5062 <0.0001 6 27.9425 0.0153 0.8191Y1 14 1708.01 0.9347 <0.00014 4.63795 0.5133 0.

18、00204 2.26574 0.2508 0.0273 6 0.43585 0.0482 0.7870Y2 14 7.33954 0.8123 0.01434 8.66381 0.6095 0.00624 1.00214 0.0705 0.5982 6 0.33840 0.0238 0.9827Y3 14 10.0043 0.7038 0.1119 Á Â Ã x1 x2 x3 1x4 x1 x2 x3 2x4 x1 x2 x3 3x4 ÁÂÃÁ Â Ã Ä ÁÂ Â

19、;Â ÃÂ ÄÂ ÂÁ ÃÁ ÃÂ ÄÁ ÄÂ ÄÃ Â 98Y1Y2NaOH (%) 2.05 2.02( ) 73.68 88.87(mL) 30.46 102.27( h) 5.72 9.41 Max Min (%) 90.60 0.72 (%) 88.14 0.75圖 3 濃度和溫度對蛋白質含量的響應曲面和等高面圖 2 濃度和溫度對純度的響應曲面和等高面馬 森，盧家炯,高俊永，初蘭娜，杜林繁·超聲-

20、酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究極其顯著，其他均不顯著。 因此，濃度和溫度的一、二次項系數是影響 -1，3-葡聚糖的主要因素。2.3.3 響應曲面模型建立應用 SAS9.1.3 通過最小二乘法擬合得到二次多項式回歸模型：Y1=88.5466 -2.55x1-7.3758x2-0.8158x3-1.1616x4-5.9250x12+0.36x2x1-12.3687x22+1.4975x3x1-1.7575x3x2-0.8512x32-0.1325x4x1-0.02x4x2+1.2275x4x3-4.205x42Y2=1.233333 -0.460833x1-0.401667x2+0

21、.032500x3-0.108333x4+0.472083x1x12- 0.0675x1x2+ 0.515833x22+0.08 x3x1- 0.2475x3x2+ 0.072083x32+ 0.07x4x1- 0.175x4x2-0.035000x4x3+0.083333 x422.3.4 響應面分析三維響應曲面圖可以直觀反映影響因素對響應值的影響，曲面較陡說明影響顯著，曲線平緩說明影響不顯著。 等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著。 濃度和溫度對純度的響應曲面和等高面見圖 2，濃度和溫度對蛋白質含量的響應曲面和等高面見圖 3。由圖 2圖 3 的

22、曲面圖所示，溫度（X2）對純度（Y1）的影響較大，濃度（X1）對蛋白質含量（Y2）的影響較大 ，濃度和溫度的交互作用對純度較明顯。為進一步確定穩定點，對模型進行了典型分析。 運用數學的方法來查找響應曲面的穩定點，能夠檢驗出穩定點是最大點、最小點還是鞍點，結果見表 7。由表 7 可知，純度的穩定點是最大值，蛋白質含量的穩定點是最小值。 在濃度為 2.05 %、溫度為 74 、用量為 30.50 mL 和時間為 5.7 h 條件下，純度理論最大值達到 90.60 %；當濃度為 2.02 %、溫度為 88.87 、用量為 102.27 mL 和時間為 9.41 h 時，蛋白質理論含量最小值為 0.7

23、2 %。 因此，為了得到高純度、低蛋白質含量、合適的得率以及節約試劑和便于控制等問題，選取濃度為2.05 %、溫度為 74 、用量為 30.50 mL 和時間為 5.7 h進行分析是合適的。 此時，實際測定 3 次，得純度平均值為 88.14 %，于預測值相比，相對偏差為 1.04 %；蛋白質含量為 1.19 %，得率為 10.21 %。3 結論提出了超聲-酶-堿法提取酵母 -1,3-葡聚糖的工藝。 采用 Box-Behnken 設計， 響應曲面分析法研究NaOH 濃度、溫度、用量和時間對 -1,3-葡聚糖的影響，并建立了純度和蛋白質含量的二次多項式回歸模型。 通過相關方差分析證明模型是合理可靠的，能夠較好地預測啤酒酵母 -1,3-葡聚糖的評價指標。得到最優工藝條件為：功率為 140 W 的超聲波處理 60 min 后，破壁率達到 94.22 %；添加 208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 的條件下酶解 8 h， 蛋白質去除率達到最大值62.82 %； 加入 30.50 mL 濃度為 2.05 %的 NaOH，74 處理 5.7 h，最終 -1,3-葡聚糖的得率為 10.21 %，純度為