1、中閣怒孕督彼2012,28(11):47-50ChineseAgriculturalScienceBulletinTRAIL誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究進展高錚,金天明(天津農學院動物科學系，天津300384)摘要:TRAIL具有選擇性殺傷腫瘤細胞而對大多數正常細胞沒有明顯毒性，可通過TRAIL胞外及胞內凋亡通路發揮誘導腫瘤細胞凋亡作用，而正常細胞則通過NF-kB介導、誘騙受體及c-FLIP調節來逃逸TRAIL誘導的凋亡。TRAIL與基因治療、抗死亡受體的單克隆抗體、化療、放療藥物及蛋白酶體抑制因子的聯合使用能明顯提高腫瘤治療的敏感性，同時還可以逆轉腫瘤細胞對TRAIL的耐藥現象。因此TRAIL

2、作為新一代抗腫瘤藥物有望應用于臨床治療。關鍵詞:TRAIL;細胞凋亡；腫瘤；治療中圖分類號：S857.4文獻標志碼:A論文編號:2011-3970ProgressonMechanismofApoptosisTumorCellsInducedbyTRAILGaoJing,JinTianming(DepartmentofAnimalScience,Tianjin.AgriculturalUniversity,Tianjin300384)Abstract:TRAILcouldselectivelyinducedtheapoptosisoftumorcells,butnotthebulknormalh

3、adcleartoxicity.TRAILcouldinducedtumorcellstoapoptosisthroughextracellularandintracellularapoptoticpathway,howevernormalcellscouldescapedinductionofTRAILthroughNF-kBmediated,decoyingreceptorsandregulationofc-FLIP.ThetherapeuticalliancebetweenTRAILandgenetherapy,monoclonalantibodyagainstdeathreceptor

4、,chemotherapy,radiotherapydrugsandproteasomeinhibitorcouldelevatedthesensitivityofoncotherapy,meanwhilecouldreversedthephenomenonofresistanceoftumorcellstoTRAIL.Therefore,TRAILmightbecameanewgenerationantitumordrugtoclinicaltreatment.Keywords：TRAIL;cellapoptosis;tumor;therapy基金項目：國家自然基金項目“TRAIL和枷基因重

5、組腺病毒的構建及其對禽白血新腫痛細胞的抑制作用”(31072109);天津市高等學?？萍及l展基金“APP箭影栽體豬巴氏桿菌基因疫苗的研究>"(20060720)；天津市自然科學基金重點項目M<Ad-TRAIL-2A-HN的構建及其對MD腫痼細胞的抑制作用”(12JCZDJC22100).第一作者簡介：高孫女，1982年出生，天津人，碩士.通信地址:300384天津市西青區津靜路22號,TelE-mail：gj090329.通訊作者：金天明，男，1968年出生，內蒙古通遼人，教授，博士，研究方向：分子免疫病理學。通信地址:300384天津市西青區

6、津靜路22號，TelE-mail：jtm680.收稿日期：2011-12-30,修回日期:2012-03-07.0引言腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNFrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)是Wiley等首次從人心肌cDNA文庫中克隆出來，其氨基酸順序具有TNF超家族的結構特征，是與FasL具有較高同源性的TNF超家族的新成員，因其能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉化的人淋巴細胞凋亡，故又稱為凋亡素2配體(Apo2ligand,Apo2L)。TRAIL能與死亡受體結合，啟動凋亡信號轉導途徑，誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞沒

7、有明顯的毒副作用。TRAIL與化療、放療、藥物蛋白酶體抑制因子等相結合使用，可增加TRAIL對腫瘤細胞的敏感度，進而協同提高了對腫瘤細胞的療效，因此,TRAIL的聯合應用有望成為為腫痛治療的研究熱點。本研究就其結構、凋亡機制及抗腫瘤研究等方面最新進展綜述如下。1TRAIL及其受體1.1雞TRAIL基因雞TRAIL基因同樣來自于TNF家族，在細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡方面發揮重要作用。雞TRAIL基因全長1134bp,其中，912bp的開放閱讀框與人的同源性為54.4%。可溶性TRAIL的胞外區8941134bp片段可有效地抑制多種腫瘤的形成和生長。雞的基因能在脾臟和單核-巨噬細胞系等處高水平表

8、達。1.2 TRAIL受體1.2.1死亡受體目前己證實TRAIL共有5種受體，其中，TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5為死亡受體，屬于TNF受體家族成員。DR4和DR5分別由468個和411個氨基酸組成，同源性為55%,二者除了都含有TRAIL胞外連接區和一段能將受體錨定于細胞膜上的氨基酸外，同時還包含1個由70個氨基酸組成的死亡結構域，這兩種受體在機體內分布很廣叫當TRAIL與死亡受體結合后可將死亡信息傳遞到細胞內，激活Caspase通路，進而誘導產生很強的細胞凋亡效應。1.2.2誘騙受體DcRI和DcR2為誘騙受體(decoyreceptor,DcR)。其中，DcRI(de

9、coyreceptor1)由259個氨基酸組成，無胞漿區。盡管DcRI與DR的結構十分相近,但其胞內缺乏DD,故不能激活細胞死亡通路。當DcRI與TRAIL結合后，可競爭性抑制TRAIL與DR4和DR5的結合，從而發揮一定的凋亡抑制作用。DcR2由386個氨基酸組成，胞漿內僅保留2個DD的氨基酸，由于DcR2的DD不完整，呈截斷排列，故又被稱TRUNDD(TRAILreceptorwithatruncateddeathdomain)o由此可見，DcR2與TRAIL結合并不能介導凋亡。在睪丸、胸腺、結腸、小腸、外周血淋巴細胞以及前列腺等組織中DcR2的mRNA均有表達。DcR2與DcRI的1個顯

10、著區別是前者含有1個胞漿結構域，該結構域可促進抗凋亡轉錄子NF-kB的活化。1.2.3可溶性受體護骨素(osteoprotegerin,OPG)又被稱為TRAIL的另一種可溶性受體。OPG為分泌型糖蛋白，是TNF超家族的又一新成員，OPG與TRAIL連接后可競爭性地抑制TRAIL與DR4和DR5的結合，對TRAIL誘導的細胞凋亡起阻礙作用,但TRAIL與OPG的連接作用與DcRI和DcR2相比要弱得多。在研究對激素有抗性的前列腺癌細胞時發現，由腫瘤細胞產生的OPG與其對TRAIL的敏感性呈明顯的負相關叫2TRAIL誘導凋亡的途徑及機制對TRAIL誘導凋亡的具轉傳導通路尚不清楚。目前，已知TRA

11、IL與受體結合后形成的三聚體可激活下游的效應分子,再通過不同的信號轉導途徑在不同的組織發揮多種生物學效應。2.1TRAIL胞外凋亡通路TRAIL胞外誘導凋亡的途徑是，其分別與DR4和DR5結合，使TRAIL三聚體化并激活胞膜TNF受體超家族成員>不斷募集Fas分子相關蛋白(Fas-assotateddeathdormain,FADD),FADD以其N端的死亡效應結構域(deatheffectordomain,DED)結合procaspase-8的DED,形成死亡誘導信號復合物(DISC),DISC可刺激并活化Caspase-8和Caspase-10,活化后的Caspase-8催化Casp

12、ase蛋白酶產生級聯放大反應，再鏈式激活和水解其下游的Caspase-6和Caspase-7同源酶，藉此完成由Fas介導的死亡信號轉導過程，最后激活其效應物Caspase-3,進而發揮誘導細胞凋亡的生物學功能。研究進一步發現，包含Caspase相關招募域(caspaseassocatedrecruitmentdomains,CARD)的蛋白質在誘導細胞凋亡過程中至關重要。CARD在Caspase前體結構域的N末端富含一段保守的a螺旋，它可使蛋白質間發生功能聯系，包含CARD結構的蛋白質有可能是Caspase-2、Caspase-4>Caspase-9和APAF-1等促凋亡蛋白，或者是cl

13、APl和C1AP2等抗凋亡蛋白，這些蛋白在啟動細胞凋亡過程中發揮重要作用。抗細胞凋亡的CARD蛋白與Caspase的CARD蛋白相互作用，通過抑制凋亡蛋白(IAP)結構域進而抑制Caspase的活性，因此，若CARD蛋白調節失調或功能障礙時，可誘發腫瘤的生成或在化療時產生耐藥性叫TRAIL胞內凋亡通路TRAIL胞內凋亡通路是一條線粒體依賴性的凋亡通路，其能夠接受Bcl.2蛋白家族中促凋亡因子和抗凋亡因子相互調控。Bcl-2家族促凋亡成員Bid的C端部分被Caspase-8活化后轉位至線粒體膜，從而降低或破壞了線粒體的跨膜勢能,使線粒體膜的通透性增加，釋放出可溶性分子，如細胞色素C(Cytoch

14、romeC,Cyt-C)>procaspase-9和Smac/DIABLO等死亡因子到胞質中,Cyt-C可刺激凋亡復合體的形成，在APAF-LCyt-C和dATP的參與下,procaspase-9自身催化形成有活性的Caspase-9，隨后分別激活下游的procaspase-3、procaspase-6和procaspase-7。同時，裂解的Bid刺激線粒體釋放SmaSmac和Smac/DIABLO，使之與IAP分子發生特異性結合，進而解除凋亡抑制因子對Caspase的阻礙作用，激活各級Caspase,引起級聯反應，從而促進細胞凋亡叫上述兩條凋亡通路最后匯合于Caspase-3,后者催化

15、多種與凋亡形成有關的靶分子分解，導致細胞發生凋亡反應。除了通過FADD募集Caspase-8誘導細胞凋亡外,TRAIL與其受體結合后，還通過活化腫瘤壞死因子相關死亡域蛋白(TNFR1-assosiateddeathdomainprotein,TRADD),活化后的TRADD募集RIP和TNFR2,激活NF-kB通路，最終實現細胞凋亡叫3正常組織和細胞避免TRAIL殺傷的機制3.1由NF-kB介導和調控的凋亡通路在TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的過程中，NF-涕發揮的作用比較復雜。NF-小由RelA和cRe】等5個亞基組成，其促凋亡和抗凋亡雙重功能的實現取決于NF-xB-Rel和RelA亞單位的表達

16、。當Rel-A過表達時，能夠抑制DR4、DR5和Caspase-8的表達，促進IAP1和IAP2的表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡；當c-Rel過表達時，則促進DR4和DR5的表達，抑制TRAF1、BcXL、IAPl、TRAF2、cFLIP和IAP2的表達，從而促進凋亡。3.2誘騙受體的保護作用正常組織細胞中可廣泛表達誘騙受體DcRl和DcR2,而在新鮮分離的腫瘤組織或腫瘤細胞系中卻未見表達，究其原因可能是由于正常細胞中表達的DcR能與DR4和DR5競爭結合TRAIL,從而使其免于殺傷，而腫瘤細胞由于缺乏DcR而易被TRAIL捕捉并殺傷。研究發現，原始角質細胞和轉化細胞表面的TRAIL各類受體的表達

17、情況相似，但后者對TRAIL的敏感性卻比前者高出近5倍叫上述結果說明，DcRl和DcR2在腫瘤及正常細胞表面表達的廣泛性以及TRAIL調節的凋亡機制尚不十分清楚。換言之,DcRl和DcR2并不是TRAIL敏感度的唯一調節者，還可能存在其他的調控機制。3.3 c-FLIP的調節作用c-凋亡調節蛋白(c-flicelikeinhibitoryprotein,c-FLIP)是TRAIL誘導凋亡的重要調節因子，其結構和序列與Caspase-8和Caspase-10很相似，在N-端含有與Caspase-8相似的2種表達形式，即c-FLIP1和c-FLIPso兩者都包含2個DED區，其中，c-FLIP1有

18、1個caspase同源結構域，但無caspase活性，兩者被募集到DISC后，通過與Caspase-8酶原競爭性結合FADD,阻止功能性DISC形成，使Caspase-8保持失活狀態而無法激發胞外凋亡通路，進而抑制TRAIL誘導細胞凋亡叫4TRAIL在腫瘤治療中的應用盡管TNF-a和FasL都能誘導腫瘤細胞凋亡，但TNF.a在死亡信號傳遞過程中能激活NF-xfi,而激活的NFxB又能誘導巨噬細胞和內皮細胞炎癥基因的活化，因此,TNF-a全身應用時可引起嚴重的炎癥反應綜合征。這即是在試驗中，當對腫瘤小鼠注射抗Fas抗體時，可使肝細胞表達足夠量的Fas,從而引起肝細胞凋亡，是敲終導致小鼠突然死亡的

19、主要原因。因此,TNF-q和FasL的毒副作用極大地限制了TRAIL在腫瘤治療中的應用。目前，針對TRAIL的腫瘤治療研究主要集中在以下幾方面：4.1TRAIL的基因治療TRAIL對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用取決于正常細胞和腫瘤細胞表面死亡受體表達水平的差異，又由于況4/L對NF-kB的激活作用微弱，即便是全身用藥也不會產生嚴重的炎癥反應，并且TRAIL誘導細胞凋亡的機制不同于放療和化療，它可以不依賴于p53所處的功能狀態，究其原因是死亡受體可通過p53非依賴性途徑誘導細胞凋亡，特別是對于p53途徑失活的腫瘤細胞，能夠繞過p53途徑從而達到有效治療腫瘤的目的，因此，不管p53活性狀況如何，TRA

20、IL都能誘導多種腫瘤細胞發生凋亡。顯而易見，應用TRAIL進行腫瘤治療具有十分重要的理論和現實意義”0)。因此，如何提高沖ZL在活體內的半衰期以維持其在靶細胞內的有效濃度，進而抑制腫瘤細胞的生長是該研究領域的重點和難點。目前已有學者通過構建含有功能基因的重組腺病毒并導入腫瘤細胞，使TRAIL功能蛋白特異性持續表達，進而實現誘導腫瘤細胞凋亡的目的。2005年中國批準了重組人TRAIL基因并進入臨床試驗階段，國外對TRAIL重組蛋白的臨床研究也進展迅速。4.2抗死亡受體的單克隆抗體腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的抗性還和細胞表面DR與DcR的比例有關。盡管TRAIL能夠誘導腫瘤細胞凋亡，但由于有些腫

21、瘤細胞能夠高表達DcR而免于凋亡。為了防止這種現象的發生,Ichikawa等】制備了抗DR5的單克隆抗體TRA-8,臨床試驗顯示，TRA-8對原發性和轉移性肝癌細胞敏感，而對正常肝細胞沒有凋亡作用，且腫瘤細胞對TRA-8的敏感性呈劑量依賴關系。4.3 TRAIL與化療、放療相結合提高腫瘤細胞表面死亡受體的表達細胞表面DR的表達水平可在一定程度上反映腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性。有越來越多的研究人員通過提高TRAIL誘導腫瘤細胞株的凋亡敏感性，進而上調TRAIL的抗腫瘤效應。進一步研究證實，TRAIL聯合應用低于常規劑量的化療藥物，可明顯上調腫瘤細胞表面DR的表達強度，增加TRAIL對腫

22、瘤細胞的敏感度，進而協同提高了對腫瘤細胞的療效時。通過對結腸癌、神經膠質瘤和乳腺癌等惡性腫瘤細胞的電離輻射，可明顯提高上述細胞對TRAIL的敏感性間,而出現上述試驗結果的可能原因是輻射導致DR表達量升高，從而協同了腫瘤細胞對TRAIL的敏感性。4.4 TRAIL與蛋白酶體抑制因子的聯合使用TRAIL和蛋白酶體聯合使用可誘導腫瘤細胞凋亡叫。蛋白酶體抑制因子在腫瘤治療過程中能夠抑制細胞周期和NF-kB的活性，使c-FLIP的表達量減少，進而在不同細胞表面誘導DR4和DR5發揮各自的生物學效應，提高腫瘤細胞對TRAIL的敏感性，因此，蛋白酶體在誘導細胞凋亡過程中扮演著調控樞紐的重要角色。4.5其他新

23、的治療方法熱休克蛋白（Heatshockprotein,HSP）也是一種有效的治療腫瘤的試劑。HSP90抑制因子17-AGG己進入臨床前試驗階段，抑制因子17-AGG與TRAIL>HGS-EFR1和HGS-ETR2聯合應用，在誘導腫瘤細胞凋亡方面顯示出了良好的協同作用向。這些分子伴侶蛋白是分子內蛋白質正確折疊和裝配的必需元件，其中,HSP90在該過程中發揮著至關重要的作用，抑制HSP90的活性可導致細胞周期停滯和細胞凋亡。相反，通過穩定NF-kB和AKT從而使腫瘤細胞免于凋亡。6TRAIL在腫瘤治療中的應用前景現有的研究表明，TRAIL參與了機體的免疫調節、免疫監視和免疫自穩等過程，對病

24、毒感染性疾病、腫瘤性疾病和自身免疫缺陷型疾病等都有一定的抑制作用。許多實驗室都通過不同的研究方法對TRAIL的結構、作用機制及生物學功能進行了研究和探索，但TRAIL在體內的確切作用和抑瘤機制迄今尚不十分清楚，特別是對腫瘤細胞與正常細胞中凋亡的選擇性作用機制等方面還有許多問題亟待解決，因此，對TRAIL的臨床應用要持樂觀和謹慎的態度。鑒于TRAIL無論在體內還是在體外均具有肯定的抑瘤效果，目前研究的重點和亟待解決的主要問題可概括為：（1）明確受體缺陷時TRAIL與疾病發生的關系；（2）進一步闡明TRAIL與其受體功能及信號轉導途徑，以及部分腫瘤細胞對TRAIL的抵抗（耐受）機制：（3）嘗試不同

25、重組TRAIL載體的構建和單克隆抗體的研究；（4）通過對TRAIL蛋白包裝和修飾，延長其在體內的半衰期；（5）選擇靶向性的功能載體，使功能性TRAIL蛋白能夠在體內持續表達；（6）闡明TRAIL與化療藥物協同作用的機制和安全性。characterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis(J.Immunity,!995,3:673*682.2 PanG,O'RourkeK,ChinnaiyanAM,ctal.ThereceptorforthecytotoxicligandTRAIL。.Science,1997,276(53

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