1、人乳頭瘤病毒16L1原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建作者：左鳳瓊 趙素蘭 李婉宜 李曉紅 呂梅勵 蔣中華 李明遠 歐陽運薇【摘要】 目的：構(gòu)建人乳頭瘤病毒16L1的原核表達質(zhì)粒，為下一步探討蛋白的表達以及蛋白的功能研究作準備。方法：以臨床HPV16陽性標本為模板，PCR擴增L1的片段，L1片段經(jīng)EcoR和Sal雙酶切后,插入載體pGEX4T1，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，平板篩選獲得pGEX4T1/HPV L1的陽性質(zhì)粒。通過酶切、測序驗證質(zhì)粒的正確性。結(jié)果：構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX4T1/HPV16L1，并通過酶切、測序等方法驗證其完全正確。結(jié)論：成功構(gòu)建的pGEX4T1/HPVL1為今后的蛋白的表達和功

2、能研究打好了堅實的基礎(chǔ)，為HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。 【關(guān)鍵詞】 人乳頭瘤病毒16；質(zhì)粒；構(gòu)建宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有37萬新發(fā)病例，有20萬婦女死于宮頸癌。近年來，人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）感染被認為與大多數(shù)宮頸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)1。據(jù)報道，99%以上的宮頸部位腫瘤可檢測到HPV DNA的存在。因此,研究HPV疫苗對于宮頸癌的預防和治療具有重要作用。迄今已發(fā)現(xiàn)的乳頭瘤病毒多達100多型，其中HPV16與宮頸癌關(guān)系最為密切。HPV癌蛋白E5、E6、E7具有刺激生長和轉(zhuǎn)化功能2,3。E5是細胞膜或內(nèi)膜整合蛋白。在感染細

3、胞克隆早期的繁殖、擴張中起重要作用。HPV的外殼蛋白L1是保護性抗原,具有較強的保守性：在選擇壓力等外界作用下變異很小。不同型別蛋白氨基酸序列同源性高達60%。本課題選擇HPV16的保護性抗原L1所在基因片段為目標，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，為獲得具有預防宮頸癌作用的蛋白作準備。 1材料 主要儀器有凝膠成像儀購自Media Cybernetics（USA）公司，電泳儀購自BioMad公司。主要試劑：PremixTag,限制性內(nèi)切酶EcoR和Sal、T4 DNA連接酶為TaKaRa產(chǎn)品,DNA相對分子質(zhì)量標準(DL2000)為北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品,DNA相對分子質(zhì)量標準DNA/Hind為TaKa

4、Ra產(chǎn)品,膠回收使用上海華舜生物公司試劑盒Gel Extraction Min Kit。質(zhì)粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep Kit。HPV16陽性患者子宮頸細胞來自四川大學華西婦產(chǎn)兒童醫(yī)院。大腸桿菌JM109購自TaKaRa 公司。pGEX4T1質(zhì)粒由本室保存。 2方法 2.1HPV16L1基因擴增根據(jù)GenBank中查得的東亞型HPV16全基因序列(基因登陸號AF534061)設(shè)計擴增HPV16 L1基因的上下游引物。上游引物5'GCGGAATTCATGCAGGTGACTTTTATTTACA3'，下游引物5'GCGGTCGA

5、CTAAAAATTTGCGTCCTAAAG3'上、下游引物5端分別設(shè)有EcoR和Sal酶切位點，所擴增的目的片段長度為1485 bp，引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。以HPV16陽性子宮頸細胞DNA為模板克隆HPV16 L1基因。PCR擴增條件為94預變性4min，變性9430s,退火5335s,延伸721.5min,最后7210 min后終止反應(yīng)。 2.2HPV16L1原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建對PCR產(chǎn)物和pGEX4T1載體分別用EcoR、Sal雙酶切和瓊脂糖電泳回收目的片段，經(jīng)T4連接酶16過夜連接HPV16L1和pGEX4T1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，Am

6、p平板篩選陽性克隆。陽性克隆經(jīng)EcoR、Sal雙酶切和PCR鑒定，獲得初步正確的克隆。將該克隆送TaKaRa公司測序。 3結(jié)果 3.1PCR擴增HPVL1蛋白基因以HPV16陽性子宮頸細胞DNA為模板，用L1基因的特異引物進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1。可見，2000bp與1000bp中間處有一明顯條帶，大小與預期值相符（1485bp）。 3.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定轉(zhuǎn)化JM109之后，陽性菌落經(jīng)EcoR或Sal單酶切鑒定顯示，產(chǎn)物為約5500bp的單一片段；用EcoRI和Sal雙酶切鑒定顯示，產(chǎn)物為約5000bp和約1500bp的兩個片段。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒單酶切的片段大小與理論

7、值相符（5454），雙酶切后的大片段為載體片段，小片段為插入片段，均與理論值相符（大4969bp，小1485bp）。電泳結(jié)果見圖2。 3.3重組質(zhì)粒插入基因的序列測定利用pGEX4T1通用引物對重組質(zhì)粒的插入片段進行測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中插入的目的片段L1基因與Genbank報告的序列和氨基酸序相同，而且L1基因插入到真核表達載體中，插入的方向正確，未改變外源基因的閱讀框架。進一步證實了重組質(zhì)粒為陽性重組子。 4討論 HPV型別繁多，有100多種，其中以HPV16在子宮頸癌中最為常見，占全部HPV的50%以上，其次是HPV18，約占18%4。有文章報道HPV16感染患者發(fā)生子宮頸癌的危險是無

8、感染者的506倍5。 HPV是具有特異性嗜上皮細胞的DNA病毒,其基因主要包括E1E7早期基因和L1、L2晚期基因，前者主要是調(diào)控基因，具有轉(zhuǎn)化作用。L1、L2是結(jié)構(gòu)蛋白，具有強的抗原性，為預防性疫苗研究的熱點。 本研究選擇HPV16東亞型的保護性抗原L1為目的基因，構(gòu)建了其原核表達質(zhì)粒pGEX4T1/HPVL1，通過酶切，測序等方法驗證了其正確性，為下一步HPV16L1蛋白的表達奠定了堅實的基礎(chǔ)，為HPV16L1的保護性疫苗的研究提供了有益的支持。【參考文獻】 1 Bosch FX, lorincz A, Nuroz N, et al. The causal relation between

9、 human papillomavirus and cervical cancerJ. J Clin Pathol, 2002, 55(4): 244265.2 Psyrri A, Defilippis RA, Edwards APB, et al. Role of the retinoblastoma pathway in senescence triggered by repression of the human papillomavirus E7 protein in cervical carcinoma cellsJ. Cancer Res,2004, 64(9): 30793081

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