1、孔圣枕中丹對癡呆動物模型抗凋亡作用及機制的研究     【摘要】  目的：研究孔圣枕中丹抗癡呆動物模型海馬神經元細胞凋亡的作用及機制。方法：將50只Wister大鼠隨機分為正常組、模型組、腦復康組、孔圣枕中丹低劑量組、高劑量組，每組10只。除正常組外，將其余大鼠制成血管性癡呆大鼠模型。給大鼠灌胃后，采用流式細胞技術檢測神經元凋亡率及bcl-2的表達，采用免疫組織化學法觀察p53的表達。結果：孔圣枕中丹、腦復康均能降低血管性癡呆大鼠腦海馬神經元凋亡率和bcl-2表達，提高p53表達，兩組比較無顯著性差異。結論：孔圣枕中丹能抑制神經元細胞凋亡，其機

2、制可能與增強p53表達、降低bcl-2表達有關。 【關鍵詞】  孔圣枕中丹；血管性癡呆；細胞凋亡；bcl-2；p5    Abstract   Objective：To observe antiapoptotic effect of Kongsheng Zhenzhong pill on hippocampus neuron of rats with vascular dementia. Methods：50 Wister rats were randomly divided into normal group，model group

3、，Naofukang treatment group，Kongsheng Zhenzhong pill treatment group 1（low dosage），group 2（high dosage）. The apoptosis rate of hippocampus neuron and the expression of bcl-2 were measured by flow cytometry,the expression of p53 was detected by immunohistochemical staining. Results：Compared with the m

4、odel group，the apoptosis rate of hippocampus neuron and the expression of bcl-2 were decreased，the expression of p53 was increased in Naofukang group and Kongsheng Zhenzhong pill group，but there is no significant difference between Naofukang group and Kongsheng Zhenzhong pill group. Conclusions：Kong

5、sheng Zhenzhong pill can alleviate apoptosis rate of hippocampus neuron through upregulating the expression of p53 and decreasing the expression of bcl-2.    Key words   Kongsheng Zhenzhong pill; apoptosis; bcl-2; p53; vascular dementia    血管性癡呆（Vascular Demen

6、tia，VD）是由缺血性或出血性及急、慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的認知障礙，以記憶減退、表情淡漠、呆滯或人格改變為主要臨床表現，其發病與細胞凋亡有關12。本實驗對中藥干預后模型大鼠海馬神經細胞凋亡與bcl-2、p53蛋白表達的關系進行了研究，現報道如下。    1   材料與方法    1.1   實驗材料    1.1.1   實驗動物   清潔級純系Wister雄性大鼠50只，體重（250±50）g，由山東醫科

7、大學動物實驗中心提供，合格證號：D20041021。將動物分籠飼養，自由飲水進食，標準飼料喂養， 飼料由山東省實驗動物中心提供。    1.1.2   藥品與試劑   孔圣枕中丹的制備：以水為基本溶劑，將龜板、龍骨打碎先煎30 min，再加入其他各藥煮沸，濃縮制成100濃度（相當于生藥1 g/mL），置于冰箱4 儲存備用。西藥對照藥品為腦復康（Piracetar），由天津金世制藥有限公司生產，批號：20030302，實驗前按0.28 g/kg體重配成混懸液備用。凋亡試劑盒Annexin V-FITC Cat.NO.51-65

8、87，PI（Cat No 51-66211E）；Bcl-2試劑盒Fluorescein（FITC）anti-mouse and rat Bcl-2，ebioscience，Cat No.11-6992；p53抗體，santa cruz，Cat No:sc-6243。    1.1.3   實驗儀器   FACSCaliber流式細胞儀，美國BD公司生產（Becton Dickinson），Image pro-plus醫學圖像處理系統，Olympus顯微鏡。    1.2  

9、實驗方法    1.2.1   分組   將大鼠隨機分為正常組，模型組，腦復康組，孔圣枕中丹高劑量組、低劑量組，每組10只。    1.2.2   造模及給藥   除正常組外其余大鼠參照改良的四血管夾閉法制備大鼠腦缺血再灌注模型，10%水合氯醛3 mL/kg（體重）腹腔麻醉，取仰臥位，頸部正中切口，分離雙側頸總動脈，穿線備用，用微型動脈夾關閉雙側頸總動脈10 min，再通10 min，反復3次，撤線，縫合3。正常組與模型組用生理鹽水灌胃，每日1次；腦復康組

10、灌胃西藥腦復康10 mL/kg，孔圣枕中丹高、低劑量組分別給孔圣枕中丹l3.5 g/kg、9.0 g/kg，灌胃給藥，每日1次，連續14 d。第15 d用4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦備用。    1.2.3   指標觀察    1.2.3.1   神經元細胞凋亡率檢測   各組大鼠斷頭后迅速取腦組織海馬區，制備單細胞懸液，調整細胞數為1×106/mL。吸取100 L細胞懸液，加5 L Annexin V-FITC 和 5 L PI，充分混勻細胞，避光25 染色15

11、 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。    1.2.3.2   bcl-2蛋白表達   細胞懸液的制備同1.2.3.1。按細胞內蛋白染色方法，加入20 L FITC標記的 bcl-2抗體，避光染色30 min，用流式細胞儀檢測bcl-2蛋白表達的熒光值。    1.2.3.3   p53蛋白表達   采用免疫組織化學法檢測。腦組織常規固定、包埋、切片，梯度脫蠟、脫水，過氧化氫室溫滅活內源性酶，檸檬酸鹽溶液微波修復抗原后，血清封閉抗原，滴加適當稀釋的一抗，

12、4 過夜。滴加生物素化二抗，37 20 min，DAB顯色，脫水，透明，封片。選取海馬區G1區，圖像分析儀上檢測平均光密度值。    1.3   統計方法    數據統計以SAS軟件單因素方差分析進行處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示。    2   結   果    2.1   孔圣枕中丹對癡呆大鼠神經元細胞凋亡率的影響   結果見表1。由表1可見，給藥后腦復康組、孔圣枕中丹低劑量組、高劑量組與模型組比較，海馬神經細胞凋亡率明顯降低（P0.05），但3組之間比較無顯著性差