1、溶菌酶的提取和系列性質測定實驗報告學院： 生物科學與工程學院班級：姓名：學號：組別：第七組 組員:實驗內(nèi)容:溶菌酶的提取和系列性質測定在研究酶的性質、作用、反應動力學等問題時都需要使用高度純化的酶 制劑以避免干擾。酶的提純工作往往要求多種方法交替應用，才能得到較為 滿意的效果。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性變性、離子交 換層析、凝膠過濾、親和層析等。酶蛋白在分離提純過程中易變性失活，為 能獲得盡可能高的產(chǎn)率和純度，在提純操作中要始終注意保持酶的活性如在 低溫下操作等，這樣才能收到較好的分離提純效果。溶菌酶又稱胞壁質酶或 N-乙酰胞壁質聚糖水解酶、球蛋白 G,是一種能 水解致病菌中黏

2、多糖的堿性酶。主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的 * , 4糖昔鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性 糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的 病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。溶 菌酶相對分子質量約為1.44X 104,是一種強堿性蛋白質，等電點在10.0以 上，并對溫度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鳥類和家禽的蛋清中， 哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿液、淋巴液等細胞中，植物卷心菜、蘿卜、 木瓜等，以蛋清含量最豐富，約為 0.3%。本實驗用雞蛋為原理，通過陽離子交換層析，硫酸俊沉淀，分子篩層析 等步驟提取溶

3、菌酶。:、實驗原理:1蛋白質提取分離技術以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化并具有生物 活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識， 但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它 們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取， 層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組 分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這 些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、儉、高溫，劇 烈機械作用而導致所提物

4、質生物活性的喪失。蛋白質的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃 細、干燥和保存。微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要 依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生 長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情 況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼， 脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很 大，另外與季節(jié)性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的

5、臟 器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若 不立即進行實驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制 備。2.柱層析技術柱層析技術也稱柱色譜技術。一根柱子里先填充不溶性基質形成固定相， 將蛋白質混合樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動相。在樣 品從柱子上洗脫下來的過程中，根據(jù)蛋白質混合物中各組分在固定向和流動 相中的分配系數(shù)不同經(jīng)過多次反復分配，將不同蛋白組分逐一分離。根據(jù)填充基質和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離蛋白質的經(jīng)典層析技術。3電泳技術聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應，它具有兩種形式，一種

6、 是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依 三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術首先 是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子 去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大 小，電荷因素可以忽視。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子 間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如琉 基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加 入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸

7、側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就 消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠 有較高的分辨率。濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品 加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當 樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后， HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷， 因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電 泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在

8、后面形成低電導區(qū)，而電場 強度與低電導區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子 迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間 層。此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關具體實驗內(nèi)容一、實驗目的1、提取雞蛋清中的溶菌酶2、測定蛋白質濃度3、測定溶菌酶的酶活力二、實驗儀器及材料1、儀器：柱層析系統(tǒng)(層析柱，包流泵，紫外監(jiān)測儀，部分收集器)，Sigma高 速冷凍離心機，722s分光光度計，透析袋，水浴鍋，電泳儀，電泳槽，紫外凝 膠成像系統(tǒng)，移液槍(1000ml,200ml,100ml),燒杯，玻璃棒，容量瓶，移液管， 洗

9、耳球，2、材料：新鮮雞蛋。3、試劑：(1)弱酸性陽離子交換樹脂；(2)磷酸氫二鈉；(3)磷酸二氫鈉；(4)氯化鈉；(5)硫酸俊；(6)氫氧化鈉；(7)甘油；(8)鹽酸；(9)葡聚糖凝膠G-50; (10) 溶壁微球菌干粉；(11)考馬斯亮藍G-250; (12) 95%乙醇；(13) 85%磷酸；(14) 牛血清清蛋白(BSA); (15) K; (16)丙烯酰胺(Acr); (17)甲叉雙丙烯酰胺(Bis); (18)四甲基乙二胺(TEMED); (19)甘氨酸(Gly); (20)過硫酸俊(AP); (21)考馬斯亮藍R-250; (22)三羥甲基氨基甲烷(Tris); (23) 2-0-

10、琉基乙醇； (24)十二烷基磺酸鈉(SDS); (25)澳酚藍；(26)冰醋酸；(27)標準蛋白：SDS-低相對分子質量標準蛋白.4、試劑配制0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0;(2) 0.5mol/L NaOH; 200ml 0.5mol/L HCl; 200ml(4)含50%甘油的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0; 200ml,現(xiàn)配。(5)含0.05mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0;現(xiàn)配。(6)含0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0;現(xiàn)配。 含0.1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0;現(xiàn)配。(8)測活緩沖液：含30mmol/L

11、NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0;現(xiàn)配。(9)底物溶液I: 40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL測活緩沖液中；現(xiàn)配，公用。(10)考馬斯亮藍G-250試劑：考馬斯亮藍 G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸儲水稀釋至1000mL，濾紙過濾；公用。(11)標準蛋白質溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0 配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；公用。(12)底物溶液H: 300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml測活緩沖液中；(生 物技術班不用配制)。(13) 10mol/L月尿，測活緩沖液配制；(生物技術

12、班不用配制)。(14) 30%膠貯液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g；(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 ;購買，不用配。(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8;購買，不用配。(17) 10% (W/V)過硫酸俊；現(xiàn)配。(18) SDS 電泳緩沖液：25mmol/L Tris , 0.192mol/L Gly, 0.1% (W/V)SDS;(19) 10% (W/V) SDS;公用。(20)染色液：0.2g考馬斯亮藍 R-250, 42mL工業(yè)酒精，10mL冰醋酸，加蒸儲水至50mL;(21)脫色液：5mL冰醋酸，45mL

13、工業(yè)酒精，50mL蒸儲水；100ml(22)保存液：7%冰醋酸；現(xiàn)配。(23) 2X上樣緩沖液：購買，不用配。0.5mol/L Tris-HCl pH 6.82mL甘油2mL20%SDS2mL0.1%澳酚藍0.5mL2-B-琉基乙醇0.5mL蒸儲水2.5mL三：實驗步驟1酶的提取（一）樣品的制備：新鮮雞蛋四個，破蛋殼取出蛋清，加入蛋清體積1.5倍的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）,攪拌均勻，并調pH7.0 （NaOH調pH）,然后用八層紗布過 濾，留取上清液，量取體積并記錄，留 0.4mL上清液（定為I步驟樣品）并加 入0.4mL甘油-20 C凍存?zhèn)溆谩＃ǘ╆栯x子交換層析1 .陽

14、離子交換柱的再生：20g陽離子交換樹脂用0.5mol/L NaOH浸泡30min, 水洗至中性，再用0.5mol/L鹽酸浸泡30min,水洗至中性。2 .平衡：在燒杯中將再生好的陽離子交換樹脂用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0平衡。3 .吸附：在已平衡好的陽離子交換樹脂中加入蛋清樣品，攪拌吸附1h （玻璃棒攪拌）。4 .洗滌：倒去其余上清液，樹脂用100mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0洗 滌3遍。5 .裝柱：將樹脂攪拌均勻裝入離子交換柱，再用 300mL含0.05mol/L NaCl 的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0洗滌雜蛋白。（裝柱前，先檢查層析柱是否 干凈，

15、保證所有接頭密閉、管道通暢；裝柱時，流速不超過3mL/min,全過程絕對不能出現(xiàn)流干現(xiàn)象）。6 .洗脫：用300mL含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0以 3mL/min的流速進行洗脫，合并光吸收高峰管，量取體積并記錄，留 0.4mL上 消液并加入0.4mL甘油，-20C凍存?zhèn)溆茫ǘ镮I步驟樣品）。（三）硫酸錢沉淀每100mL上清液中緩慢加入35g硫酸錢固體，溶解后靜置30min, 10000rpm 離心10min,沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0溶解， 留0.05mL上清液并加入0.05mL甘油，-20C凍存?zhèn)溆茫?/p>

16、定為田步驟樣品）。 四注意事項1 .上樣前，層析柱要達到平衡。2 .上樣后要控制流速。（四）實驗數(shù)據(jù)層析譜圖開洎時間：L2/11.704 12：網(wǎng)當前忖網(wǎng)L2/11./04 14；2s1._ 00-采集敝：2則當前怕kQ.QTOr 9匕0. 601 1-Ol 4Q，-(M仇-的二型 OO： 3S 前0015201:0101： 1101:2001:2901： 3401:4g01:5®圖1酶提取儀器穩(wěn)定圖層析譜圖1.00氏州上1400：M00:38U.bL''1 'M：L2 m900:2500:5100：57開始時間：12/11/04 11:45 用樂時網(wǎng)112/

17、11/04 12:49 果集鼓：1兄。11111111111h1II1hi1111111111iiii1i<i-ii1| 1 |I|i|Il|1i|1II111I11!1111111111111I1I111111111111111|1p1|iIiib1li>i0,901-(K 40-圖2酶提取平衡圖層析譜圖采集散2潮線前怕蝮Q.QT1 _ 00- ，k1Tr4.k 90'0. E0'(K4Q-(L10-00：科 00： 3S 00:4200:3201:0101： 1101:3001:2901;3401：4001:5ft圖三酶提取洗脫圖2酶的純化2.1 分子篩層析(1

18、)溶脹：取葡聚糖凝膠G-50 3g加60mL蒸儲水沸水浴中煮沸2h,充分溶 脹后的凝膠以傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，如此反復洗滌 23次，最后加 入等體積含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸緩沖液備用。(2)裝柱：將凝膠懸浮液攪拌均勻后一次連續(xù)性傾入柱中,控制流速三15mL/h,自然沉降(注意：絕對不能出現(xiàn)“流干”現(xiàn)象，不能有氣泡和分層，膠面一定 要平整)。(3)平衡：用含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸緩沖液平衡兩個柱體積，控制流 速三 15mL/h0(4)上樣：將溶解后的硫酸俊沉淀樣品10000rpm離心3min后上樣，當樣品 進入膠面后，再用平衡緩沖液約 0.5mL洗管

19、壁和膠面3次(注意：絕對不能出 現(xiàn)“流干”現(xiàn)象和破壞膠面的平整性)。(5) .洗脫：用含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸緩沖液洗脫，控制流速三15mL/h,自動部分收集器收集，2mL/管，紫外監(jiān)測儀檢測洗脫峰或比色法測定洗脫峰。合并光吸收及酶活高峰管。2.2 透析濃縮用含50%甘油的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH4.0透析濃縮4h, -20c分裝保 存?zhèn)溆茫ǘ镮V步驟樣品）。2.3 實驗圖譜圖5酶純化峰值圖2.4 注意事項1) .層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中2) .凝膠過濾上樣時，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面3酶活力、蛋白濃度測定3.1 蛋白濃度的測定(

20、1)標準曲線的制定取14支試管，按下表分兩組進行平行操作管號0123456標準蛋白質溶液/ml00.010.020.030.040.050.06緩沖液0.100.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍 G-2505ml搖勻，1h內(nèi)以0號試管為空白對照，在595nm處比色A 595nm00.0510.0890.1190.1690.2050.235繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線吸光度圖6蛋白質測定標準曲線圖(2)測定未知樣品蛋白質濃度管號IRmIV吸光度0.1180.0560.0730.610稀釋倍數(shù)101010010蛋白濃度0.28460

21、.12581.69330.015462.酶活力測定管號12測活緩沖液/ml2.53.0底物溶液/ml2.52.5酶液/ml0.50在室溫，以1號管為對照，每隔30s測定2號595nm處的光吸收值時間樣品號0s30s60s90s120s150s180sA595nmI0.0170.1070.1350.1700.1870.2100.224R0.1240.1420.1670.1950.2130.2350.254m0.1310.1560.1810.2070.2260.2380.253IV0.2570.3280.3480.3500.3570.3660.370四、注意事項酶活測定和蛋白定量實驗中所用試管、刻

22、度吸管要干燥，量取試劑要準確SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測酶相對分子量及純度鑒定1 .配制15%的分離膠(1)用膠框封好玻璃板后架好膠板。(2)按如下比例配好分離膠，混合后立即加入到電泳槽兩玻璃板之間到上口約2cm止，再加約1ml蒸儲水水封，聚合后將水吸干。蒸儲水1.5mol/L Tris-HClpH8.8膠貯液10%SDSTEMED10%AP4.7mL5mL10mL200uL10uL100uL2.配制4%的濃縮膠蒸儲水0.5mol/L Tris-HClpH6.8膠貯液10%SDSTEMED10%AP6.1mL2.5mL1.3mL100uL10uL50uL混合后立即加到分離膠上，加入梳子。聚合后

23、裝好電泳緩沖液后小心拔出梳子。3 .樣品制備樣品與2X上樣緩沖液1:1混勻，并在100c水浴中保溫3-5min,取出待用。4 .上樣、電泳將樣品和標準蛋白加到樣品孔中， 加樣量每孔10uL,加好后開始電泳，先包壓 80V,樣品進入分離膠后包壓120V,直到澳酚藍走至距前沿1cm為止。5 .染色電泳完畢，剝膠前先將凝膠在前沿處作一標記區(qū)別正反面后再將凝膠浸泡于染 色液中染色2h.6 .脫色用脫色液脫至區(qū)帶清晰為止。五實驗結果觀察電泳后各種蛋白質和染料前沿的遷移距離，用相對遷移率Rf (樣品遷移距離/染料遷移距離)對lgM作圖，根據(jù)酶樣品的相對遷移率，求出酶的相對分 子質量。并對電泳結果照相保存。六注意事項(1) Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩，純 化應在通風櫥內(nèi)進行。(2)玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣 泡。(3)樣品槽模板梳齒應平整光滑。(4)用瓊脂封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以