1、麻風樹生物柴油研究和開發進展麻風樹生物柴油研究和開發進展陳放徐鶯唐琳王勝華吳軍(四川大學生命科學學院,四川大學生物能源研究所,四川大學國際麻風樹研究中心,成都,610064)作者簡介陳放,四川大學生命科學學院院長,教授,博士生導師,生物能源研究所所長;中國可再生能源學會理事及生物質能專委會副主任,中國植物學會常務理事;主要從事能源植物及生物技術的研究與開發.近幾年來共主持承擔了國家自然科學基金,國家科技支撐計劃等國家及部省重大重點科研課題與國際合作項目10R項,主要涉及麻風樹等能源植物資源評價與育種技術,分子生物學,基因技術及生物柴油與綜合利用的關鍵技術研發等領域.參考文獻XiaoboQin,

2、XiaojiangZheng,CaixiaShao.eta1Stress-inducedcHrcinLpromoterinleavesofJatrophaCIIFC,SLandcharacterizationintransgenictobaccoPlanta,2009101007/s0042500909569參考文獻GaoS.ChenF.Ef_fectsofsaltstressongrowth.a13tioxidantenzymeandphenylalan1neammonialyaseactivitiesinJatrophaCUI"CaSLseedlingsPlantSoi1Envi

3、ron,2008f91:37438l參考文獻YangHe,VijayaPasapula,XiangLi,etalAgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationofatrophacurcas:factorsaffectingtransienttransformationefficiencyandmorphologyanalysisoftransgeniccalliSilvaeGenetica200958r31:123.12854隨著世界能源消耗量的不斷劇增,生態環境惡化加劇,能源安全與環境問題正在越來越深刻地影響著當今全球社會和經濟的可持續發展.尋求

4、發展生物能源等可再生能源或新能源來解決目前和未來的能源與環境問題已成為國際上備受關注的熱點,不少國家正在或已制定有關生物能源的發展戰略.當前正在持續的國際金融危機對新能源產業的發展帶來新的挑戰與新的機遇.作為能源消耗大國的中國也正面臨日趨嚴峻的能源與環境問題.近年來我國政府高度重視可再生能源與新能源的發展,已將其確定為國家產業發展的重點方向.大力發展生物能源是符合國情的戰略選擇.麻風樹(Jatropha.CHFCaSL.),又名小桐子,主要分布于熱帶和亞熱帶地區,主要生長在美洲和亞洲熱帶地區.在我國栽培或半野生于南方熱帶和亞熱帶地區,分布面積較廣,資源較豐富(參見圖1,圖2).近年來發現該種植

5、物在工業用油,生物化工,生物農藥,新藥開發等方面有著生物產業技術I2009.05,潛在價值,麻風樹是目前公認的最適宜開發的生物柴油樹種,并且又是干熱河谷等地區造林綠化的優良樹種,因此具有廣泛的利用前景.麻風樹的生態分布廣泛,從干熱的亞熱帶到潮濕的熱帶雨林都有其分布,它可以在年降雨量2001200mm,年平均氣溫1828.5.C的環境下生存.麻風樹常生于海拔500-1600m的平地,丘陵坡地及河谷荒山坡地,常栽培于園邊作綠籬,也有一些為半野生狀態.麻風樹喜光,喜暖熱氣候,耐干旱瘠薄已在不少國家栽培.本文主要介紹有關四川大學麻風樹生物柴油研究與開發的進展情況.1麻風樹種質資源研究和優良麻風樹類型選

6、育開展對現有麻風樹資源的篩選,評價研究,是培育麻風樹生物柴油專用品種必不可缺的工作,也是較快獲得具有栽培價值的優良麻風樹類型的方法.在從印度尼西亞,緬甸,柬埔寨,印度,馬來西亞,巴西,馬達加斯加,馬里等因睡管¨一唱一翌國家和我國四川,云南,廣西,廣東,品(O.819.46)中最低.海南等地區收集上千份麻風樹材料的基礎上,研究人員著重對其種子含油量和植株抗逆性等方面進行了研究.對麻風樹種子及種子油性質的相關數據進行方差分析,結果表明,產地不同,麻風樹種子的生物學性質,種子油理化性質和脂肪酸組成都存在一些差異.以我國西南6個地區采集的麻風樹種子為例,所有樣品的百粒重范圍為41.8071.

7、39g,出仁率為60.02%81.43%,種仁含油率為51.76%57.93%,種子含油率為31.07%47.17%,不飽和脂肪酸含量為74.89%79.68%.在種子含油量方面,以云南永勝產麻風樹的種子最高,其出仁率為81.43%,種仁含油率為57.93%,種子含油率為47.17%,不飽和脂肪酸含量為79.68%.攀枝花和寧南產麻風樹的種子次之.在酸值方面,云南雙柏和貴州羅句麻風樹的種子油酸值為0.81,在所有樣筆者研究團隊與公司合作首次開發了麻風樹種子含油量快速微量無損傷檢測方法及設備.在進行麻風樹種子含油量和水分測定時,可利用低場核磁共振分析儀進行麻風樹種子含油量的快速微量測定方法簡單,

8、結果可靠,對種子無損傷檢測出的高含油量種子可直接用于育種試驗.在耐低溫種質資源的篩選過程中發現,三個不同產地(四川攀枝花,云南紅河和永勝)的麻風樹用8C的低溫脅迫處理后,所受到的傷害(葉綠素含量減少,根系活力降低,生物膜通透性增大等指標J以云南永勝的最低,四川攀枝花的次之,云南紅河的最高,并且這種影響與資源所在地的氣溫呈負相關關系,這提示在年均氣溫較低地區可能容易發現耐寒性強的優良單株.為了確定上述變異與環境和遺傳L璧竺鑒蘭墾參考文獻王云霄,張穎,江璐玎等.麻風樹水通道蛋白新基因尼P旰旱脅迫下的功能分析.熱帶亞熱帶植物,2008,16(4):289-295.參考文獻羅孟軍,陳放,顏鈁等.麻風樹

9、核糖體失活蛋13eurein在大腸桿菌中高效表達條件自研究中國中藥雜志,2009,34【6):656-659參考文獻秦小波.麻瘋樹兩種核糖體失活蛋白的表達模式分析植物生理學通訊,2008,44(5):891896參考文獻毛俊娟,倪婷,王勝華等.干旱脅迫下外源鈣對麻風樹相關生理指標的影響四川2008,450):669-673參考文獻張正銀,劉波洋,陳放等.麻風樹AFLP體系的建立與優化.應用與環境生物,2009,15(2):280283.參考文獻張富麗,蔡峰,吳軍等.轉麻風樹甜菜堿醛脫氫酶基因提高煙草耐鹽性中國農業科學,2008,41(12):40304038WVc'WI2009.05(

10、9月).1生物產業技術55參考文獻郭亮,卿人韋,何瑋等麻風樹葉綠體克隆和鑒定應用與環境生物,2008,14(4):469474參考文獻羅紹銀,高繼海,葉生亮等一種提取富含油脂植物組織總RNA的改良SDS酸酚法.應用與環境生物,2009,15r2:284287.參考文獻林莎,羅紹銀,林穎等從麻風樹胚乳中提取總RNA的快速方法應用與環境生物,2008,14(5):692694參考文獻刁明蘇,徐鶯,陳放.麻風樹毒蛋白對小鼠器官的急性毒性研究.四JlI大學(自然科學版),2008,45(4):967971參考文獻林莎,高帆,羅洪等麻風JcTctpl基因的同源性分析及時空表達模式鑒定中國生物化學與分子生

11、物,2008,24(8):727.734參考文獻戶靜惠,吳軍,肖科等麻瘋樹花的形態結構與傳粉關系研究四川大學(自然科學版),2008,45(4):1485-1488.參考文獻江璐玎,王云霄,王迎春等.麻風樹酰基載體蛋白的基因克隆,表達分析及原核表達應用與環境生物,2008,14(6):769773因素之間的關系,進一步開展分子標記研究是非常必要的.從麻風樹9個自然居群135個樣品的ISSR分子標記研究結果來看,自然界的麻風樹具有豐富的遺傳多樣性水平(多態百分率PPB=97.04%,NeiS遺傳多樣性H=0.2357.Shannon信息指數/=0.3760)特別是群間遺傳多樣性較大(Qt=0.5

12、398),高于居群內數據.后者水平較低可能與麻風樹扦插,近交占主導的繁育方式有關.現已初步篩選出含油量高或抗逆性強的優良單株130余株.其中種仁含油量超過65%且生長快速的有120余株,耐寒單株7株,抗蟲單株5株.建立了高產優質麻風樹實生苗和扦插苗種植技術和高含油麻風樹品種選育技術,規模化育苗可達30000株/畝:在規范化人工栽培的條件下.每畝可產麻風樹種子300500kg,可加工生物柴油140180kg;通過單株系統選育,篩選出了高含油率的麻風樹新品種CSC6,其種仁平均含油量達63%,已獲得四川省品種認定證書(川RSCJC一0022005)參考文獻2現代生物技術在麻風樹生物淳三要柴油專用品

13、種培育中的應用RNA的提取方法生物化學與生物物理進,.,仆,¨.HH¨'H.幾展,2008,35(5):591?597參考文獻吳軍,王勝華,陳放麻風樹油脂含量遺傳性與CSC高油63品種的選育種子,2008,27(5):100102參考文獻RYanSGao,WYang,eta1.NickeltoxicityinducedantioxidantenzymeandDhenvla1anineammonialyaseactivitiesinJaophaCuIcasLcotyledons.PLANTSO1LENVIRON,200854,(7):29430056將現代生物技術應用

14、于麻風樹優良品種(參見圖3)的培育,是目前研究的重點方向主要包括組織培養技術和分子育種技術兩方面.以麻風樹花藥和胚乳為外植體誘導愈傷組織并進一步分化成植株已經取得成功,可以縮短麻風樹育種周期,可用于耐寒,耐鹽堿等麻風樹品種的培育.分子標記的結果提示基因遺傳因生物產業技術l2009.05(9B)素在麻風樹相關性狀的決定中具有重要作用,因此了解相關過程的分子基礎,發現其中的關鍵控制基因.對于利用現代育種技術培育麻風樹優良品種具有重要的意義,筆者研究團隊著重開展了以下工作:麻風樹胚乳cDNA文庫的建立及規模測序工作:克隆鑒定參與麻風樹油脂合成代謝的基因:克隆鑒定參與麻風樹逆境應答的基因;克隆參與麻風

15、樹性別分化與花發育的基因.現已克隆和鑒定了多個與麻風樹油脂合成及抗逆性等相關的基因,如麻風樹葉綠體o93脂肪酸脫飽和酶基因麻風樹甜菜堿醛脫氫酶基因(JcBD1),麻風樹干旱脅迫相關的水通道蛋白基因(JcPIP2),麻風樹干旱誘導差異表達基因(JcMIPS),麻風樹硬脂酰-酰基載體蛋白脫飽和酶基因,麻風樹雌性相關基因(JCFDO03)麻風樹毒蛋白(curcin)基因等,為利用基因工程技術篩選和培育麻風樹優良品種奠定了基礎.3良種快繁技術當前的麻風樹生產中,主要利用實生苗進行繁殖.研究顯示,即使這些實生苗來自于同一母株,子代植株之間,子代與母株之間含油率仍有顯著差異;與之相反,扦插苗較好地保持了母

16、株的含油率.這一結果表明,就含油量可控性方面來說,無性繁殖方式優于實生苗繁殖,從而建立了高效低成本的麻風樹無性快繁技術體系.在利用麻風樹腋芽進行繁殖時發現,KT(激動素)2,4一D(2,4一二氯苯氧乙酸)的激素搭配適于誘導愈傷組織,促進腋芽增殖需要在培養基MS+I.0mg/LBA+0.01mg/LIBA+5.0mg/LAgNO3上進行,pH值的變化對腋芽分枝的影響不大,奄廠風柴麗究幣口開發進屣采用瞬時高濃度生長素刺激或者無激素的活性炭培養基都能得到92%以上的生根率.4麻風樹栽培技術研究栽培技術是影響麻風樹原料產量的另一重要因素.當前的研究主要集中在各種脅迫條件對麻風樹種子萌發,幼苗發育以及光

17、合作用效率的影響等方面以及采摘時間和儲存時間對麻風樹種子油的脂肪酸含量和組成的影響等.4.1種子萌發特性研究研究顯示溫度對種子的儲存和萌發有顯著影響.30.C時最有利于種子萌發.剝殼種子發芽率顯著高于未剝殼種子,光照對種子萌發沒有明顯作用,播種過深會抑制種子萌發,實際生產中適于淺播.儲存溫度同樣明顯影響種子發芽率.用不同的溫度(】5.C,4.C,一20.C,一80.C)儲存麻風樹種子,在一個月和三個月取出種子測定其發芽率,脂質過氧化程度,抗氧化物酶活性的變化以及苯丙氨酸解氨酶活性的變化.隨著儲存溫度下降,麻風樹種子過氧化程度顯著提高,而丙二醛含量升高,超氧化物歧化酶活性在4.C和一20.C比較

18、低,在常溫和一80.C有所升高.超氧化物歧化酶在1個月變化不大,在3個月時候隨著溫度下降而出現明顯的上升趨勢:過氧化氫酶活性與溫度表現出明顯的正相關.苯丙氨酸解氨酶活性在1個月和3個月都沒有太大變化.SOD,POD和CAT在麻風樹種子低溫儲存的抗凍和清除活性氧簇方面都起到了關鍵作用.4.2光合生理特性研究麻風樹葉片凈光合速率日變化青果期淺黃色0.6669.2l1331黃果期淺黃色0.5459O21478新采果實亮黃色O3615l5664儲存1年果實黃褐色02429255.56儲存2年果實黃褐色0l95.6954.74及其與環境因子相互關系的試驗結果表明麻風樹凈光合速率日變化呈雙峰曲線,凈光合速

19、率最大值為14.4gmolCO,?1TI?S,光補償點為45pmo1CO,?1TI.?S,光合主峰出現在11:00次峰出現在15:30,光合主峰有一個長達4.5h的高效光合平臺期(9.814.4pmolCO,?m?S),是一天中最重要的產物積累時期.凈光合速率日變化曲線表明麻風樹光合"午休"現象明顯且氣孔限制是產生"午休"的主要原因.麻風樹光能利用率較高.最大值為3.52%.研究顯示麻風樹的光補償點和光飽和點較高,為耐干旱植物.在高溫高輻射時能有效的通過降低氣孔導度來限制蒸騰作用.4.3逆境生理研究以攀西地區麻風樹為材料,采用溶液培養實驗方法.pH值4.

20、1,設置不同溫度(24.C,29.C,34)研究不同鋁離子處理濃度(A1"濃度:0,0.Olmmol/L,0.1rnmol/L,1mmol/L,5mmol/L)對三月齡麻風樹幼苗根系活力,葉片丙二醛(MDA)含量,葉片脯氨酸(Pro)含量,過氧化物酶(POD)活性等生理指標的影響.結果表明:相同A1"濃度下,隨溫度升高,根系活力降低,MDA,Pro含量增加,POD活性增加.34.C時隨著Al"濃度增加.根系活力降低,MDA,Pro含量增加,POD活性增參考文獻ZhangY,WangY,JiangL,etalAquaporinJcPlP2isinvolvedindr

21、oughtresponsesinJatrophacrcaActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2008,39(10):785794參考文獻Wei0in,LuWeiDa,LiaoYi,etalPlantregenerationfromepicotylexplantofJatrophacrcasJPlantPhysiolMolBiol,2004,30(4):475478參考文獻黃明星,魏琴,徐鶯等麻風樹逆魔蛋白curcin2基因在煙草中的表達中國生物工程雜志,2008,27(4):94-98參考文獻LuoTong,PengShuMing,DengWuYuan.cta1.

22、Characterlzati0nofanewstearoylacylcarrierproteindesaturasegenefromJaophaCUFCSBiotechn0l0gyLetters,2006.28:657662I2009.05(9)1).I生物產業技術57一sas0l_(o"xl三焉墮lE黧一一肌一Yg唱_三li蓉一一en擘.一船炯川吣鏊一墳不于茸翻杯手U時r稱準足麻JxL樹"-I=韌柴潿判足技術指標值實際技術指標值(GB/-I-20828-2007)90%回收溫度/C不高于360345合格硫含量(質量分數)/%不大于0.05OO2合格10%蒸余物殘碳(質量分

23、數),%不大干O3O018合格硫酸鹽灰分(質量分數)/%不大于002000041合格水分(體積分數)/%不大于無運動黏度(40.C)/(mm/s)1.96.04.429合格銅片腐蝕(5C3h)/級不大于11合格機械雜質無無合格冷凝點/口C不高于報告O閉口閃點,C不低于13O162合格十六烷指數不小于47密度(20.C)/(kg/m3)820900876.2合格酸值/(mgKOH/g)不大于O80012合格參考文獻BeiNiu,HuaxunYe,YingXu,etalCloningandcharacterizationofanovelD12.fattyaciddesaturasegcaefrom

24、thetreeSapiumsebiferum.Biotechno1Lett,2007,29(6):959964.0參考文獻ZhouH,LuH,LiangBSolubilityofmulticomponentsystemsinthebiodieselproductionbytransesterificationofJatrophacuEca$L.oilwithmethanolJChemicalandEngineeringData,2006,51(3):1130-1135.參考文獻QWei,YLiao,YChen,etalIsolation,characterisationandantifunga

25、lactivityof盧一1,3-glucanasefromseedsofJatrophacurcasJournalofBotany,2005,7l(1):959958加.適度低溫適量濃度的AP(29.C:0.01mmol/LA13,24.C:0.01mmol/LAI",0.1mmol/LA)處理下.根系活力增強MDA和Pro含量降低,POD活性降低.1mrnol/L以上Al"處理下,2434.C溫度下的麻風樹都受到不同程度的傷害.29.C,pH值4.,Al3+濃度lrm'nol/L處理下,外源鈣的加入增強了根系活力,降低了葉片MDA,Pro含量和POD活性,改善了

26、酸鋁脅迫對麻風樹的影響.4.4采收果實含油率研究利用GCMS分析青果期,黃果期,黑果期及儲存1年,2年麻風樹種子油,5個油樣的水分酸值,出油率等指標有較大差異其他主要化學成分碘值皂化值差異不大.未成熟青果的出油率為13.13%,水分為0.66%,酸值為69.21,不飽和脂肪酸含量最低.新采成熟果實的出油率為54.64%,水分為0.36%酸值為1.51,不飽和脂肪酸含量也相對較高.因此,新采的成熟果生物產業技術I2009.05(9月)實較為適合作生物柴油的原料.4.5栽培技術示范在上述工作的基礎上,中國-UNDP綠色減貧項目的支持下結合四川,云南,貴州和海南的生產實踐經驗,出版了小桐子生產技術(

27、四川大學出版社,2007)一書.專門適用于農戶的小桐子生產技術手冊也已經印制散發在云南(元陽,雙柏),四川(會理,鹽源),貴州(貞豐,羅甸)和海南(樂東,臨高)等地開展技術培訓1000余人次.結合承擔的國家科技項目和國際合作項目,筆者研究團隊已在四川涼山州會理縣和鹽源縣,廣西百色市,廣東梅外市和海南等地以及印度尼西亞,緬旬,巴西等國建立了麻風樹規范栽培示范基地.四川大學同中國海洋石油公司等有關公司合作在海南等地建立了麻風樹示范種植基地還同有關研究機構與公司合作建立了國際麻風樹研究中心.5麻風樹生物柴油開發和綠色生產工藝研究由于麻風樹油的酸值一般為lO15mgKOH/g.游離脂肪酸較高,經過預酯

28、化處理使原油酸值降低到5以下.主要對預酯化反應條件進行了優選,發現反應溫度對化學反應速率有明顯影響.在通過兩次酯交換反應后,得到生物柴油酸值(mgKOH/g)低于0.6,收率96%以上.與公司合作開發了麻風樹生物柴油BIO,B20,B30,BIO0等系列產品,建立了產品質量標準,并進行了初步的車載運行試驗,相關的技術性能通過了有關部門的檢驗,在燃油性能(如閃點,凝固點,題管一x叭m一蔞蔞篡廠兩互蔡面螽翻開發進展十六烷值,硫含量,熱值,運動黏度等)多項指標均優于國產石化柴油標準與國家生物柴油標準.建立了年產5000噸麻風樹生物柴油中試基地.在此基礎上,對其放大的生產工藝和技術進行了系統研究,建立

29、了萬噸級的麻風樹生物柴油一體化聯產示范裝置,進而提高了綜合利用效益.生物催化劑是生物柴油轉酯反應研究中重要的研究對象.目前新酶種的發現和全細胞催化劑的開發是這個領域中的研究熱點.為此筆者研究了麻風樹油脂代謝的重要代謝酶脂肪酶,通過粉狀畢赤酵母表達系統初步開發了該酶的全細胞催化劑.并且研究了該催化劑對麻風樹油脂的催化效率.比較了全細胞催化劑和不同公司的固定化脂肪酶對麻風樹油脂和大豆油脂的作用效果,結果表明麻風樹油脂中油酸甲酯和亞油酸甲酯含量相當且較多,而棕櫚酸甲酯和亞麻酸甲酯略少.麻風樹脂酶全細胞催化劑對麻風樹油脂的催化能力要比對大豆油的強.6麻風樹的綜合利用開展麻風樹綜合利用研究,對于提高麻風

30、樹生物柴油產業綜合效益具有非常重要的意義.當前的利用主要集中在甘油衍生物,活性炭,飼料和肥料,生物殺蟲劑,生物醫藥產品等方面(參見圖4).6.1麻風樹抗病毒,真菌成分的研發筆者研究團隊首次從麻風樹葉中提取了以麻風樹萜醇為主要成分的混合物,發現其具有抗炎,抗菌和抗病毒作用,能有效殺滅包括金黃色葡萄球菌,白色念珠菌和黑曲霉菌在內的多種病原菌以及皰疹病毒等.并開發了用于皮膚細菌,真菌與病毒感染防治的產品.參考文獻MingXingHuang,PeiHou,QinWei,eta1Aribosoraeinactivatingprotein(curcin2,inducedfromJatrophaoLlrca

31、sreduceViralandfungalinfectionintransgenictobaccoPlantGrowthRegulation,2008,54(2):115-123參考文獻LINJuan,YANFang,TANGLin,etalAntitumoreffectsofcurcinfromseedsofJatrophacuFcasArtaPharmacolSin,2003,24(3):241246參考文獻WeiQin,HuangMingXing,XuYing,etalExpressionofaribosomeinactivatingproteinfcurcin2inJatrophaci

32、sinducedbystressJBiosci,2005,30(3):351-357參考文獻JuanLin,"tun-XiangLiXuanWeiZhou.etalCloningandcharacter1zatj0nofacurcingeneencodingaribosomeinactivatingproteinfromJatrophacurcasDNASequence,2003,14(4):311317參考文獻LinJuan,ChenYu,XuYing,etalClongandexpressionofcurcin,aribosomeinactivatingproteinfromth

33、eseedsofJatrophacurcasAetaBotancaSinica.2003,45(7)'858863.參考文獻MengJunLuo,XinYuYang,WeiXinLiu,etalExpression,PurificationandAntittllnOrActivityofCurcinActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2006,38(9):663669Biotechno1.2006.7l:222227WWWI2009.05(9月).【生物產業技術596.2麻風樹毒蛋白研究麻風樹毒蛋白是一種一型植物核糖體失活蛋白,它對正常細胞毒性極小,卻能特異性地抑制包括腫瘤細胞和