1、凝集試驗-免疫學實驗實驗一凝集試驗顆粒性抗原（細菌、螺旋體、紅細胞等）與 相應抗體結合后，在有適量電解質存在下, 抗原顆粒可相互凝集成肉眼可見的凝集塊, 稱為凝集反應(Agglutination reaction)或凝集試驗。參與凝集反應的 抗原稱為凝集原(Agglutinogen),抗體 稱為凝集素(Agglutinin)。細菌或其它凝集原都帶有相同的負電荷，在 懸液中相互排斥而呈現均勻的分散狀態。抗 原與相應抗體相遇后可以發生特異性結合, 形成抗原抗體復合物，降低了抗原分子間的靜電排斥力，此時已有凝集的趨向，在電解 質（如生理鹽水）參與下，由于離子的作用， 中和了抗原抗體復合物外面的大部分

2、電荷， 使之失去了彼此間的靜電排斥力，分子間相 互吸引，凝集成大的絮片或顆粒，出現了肉 眼可見的凝集反應。根據是否出現凝集反應 及其程度，對待測抗原或待測抗體進行定性、 定量測定。凝集反應包括直接凝集反應和間接凝集反 應兩大類，本實驗主要介紹直接凝集反應。.目的要求1. 掌握平板凝集試驗和試管凝集試驗的操 作方法。2. 掌握凝集試驗的結果判定及判定標準。3. 熟悉平板凝集試驗和試管凝集試驗所需 材料和試劑。材料與試劑1. 玻板，載玻片，試管(1cm X 8cm),試 管架，刻度吸管，滴管，微量可調加樣器, 滴頭(tip頭)，牙簽或火柴棒，記號筆。2. 滅菌的生理鹽水，滅菌的0.5%石炭酸生 理

3、鹽水。3. 布氏桿菌病試管凝集抗原，布氏桿菌病 平板凝集抗原，布氏桿菌病虎紅平板凝集抗 原，布氏桿菌病陽性血清，布氏桿菌病陰性 血清，被檢血清（牛、羊或豬）。4. 雞白痢平板凝集抗原，雞白痢陽性血清, 雞白痢陰性血清，被檢雞血清。實驗內容及操作方法（一）試管凝集試驗以牛布氏桿菌病試管凝集試驗為例。.3另取每份血清用試管4支，1.試管準備: 支試管作為對照，作好標記，置試管架上。 如份。被檢血清有多份，對照只需做10. 5% 2. 3 ml2.被檢血清稀釋：第1管加 A0. 5% 0.5 ml3. 4管加入第石炭酸生理 鹽水，2、石炭酸生理鹽水；然后用加樣器 或刻度吸管吸管中，反復吹，加入第1取

4、被 檢血清0.2 ml 0. 5 ml ml棄之，再吸取 吸5次混勻，吸取1. 53加入第0. 5 ml加 入第2管中，混勻后吸取見（混勻后吸棄 0. 5 ml管,依此類推至第4管，、1:12. 51-1 ）。 該被檢血清的稀釋度分別是表。1:50、 1:1001:25.石炭酸生0. 5% 5管中加3.對 照管制作：第稀釋的布氏桿1:256管加ml , 第0.5理鹽水稀釋的管加1:25，第7菌病 陽性血清0.5 ml O布氏桿菌病陰性血清 0. 5 ml加抗原：將布氏桿菌病試管凝集抗 原4.每支試稀釋，0.5%石炭酸生理鹽水作1:20 用。ml管加0. 5 （單1-1布氏桿菌病試 管凝集試驗術

5、式表表ml ）1L :W W i- 1 2 3 4 56 7管照對最終血清稀料度1： 25 1； 50 1： 100It 200陽性血清陰性血清康抗1:25 1 : 250,頭石炭震生理鹽水0. 5 2. 3 0. 5 0. 5 0. 50,5被檢血清02 05 05 05 050,5 抗050,50,50,50,520)(0.5小棄5感作（反應）：7支試管加完抗原后，充分混勻，置于37C溫箱中4-lOh, 取出后置室溫18-24h（或37C溫箱12-14h, 取出后置室溫2-4h；或37C溫箱中22-24 h 取出），然后觀察并記錄結果。6.結果判定：判定結果時用“ + ”表示反應 的強度。

6、根據各管中上清液的透明度、抗原 被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集 反應的程度。+ + + + ： 100%抗原凝集，上清液完全透 明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩 時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。+ + + ： 75 %抗原凝集，上清液略呈混濁, 菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如 上。（管底凝集物與100%凝集時相同，只是 上清液稍渾濁）。+ + ：50%抗原凝集，上清液渾濁半透明，。 管底有中等量的凝集物（管底有明顯的凝 集）.+ ： 25%抗原凝集，上清液完全渾濁不透明, 管底有少量凝集物或凝集的痕跡。-：抗原完全未凝集，上清液完全渾濁不注意事項1. 實驗時必須設抗原、陽

7、性血清及陰性血 清對照，以避免假陽性、假陰性的結果。牛、羊2. 結果判為可疑時，隔2-3周后采血重做。 陽性畜群，重檢時仍為可疑，可判為陽性。 對同群中既無臨床癥狀又無凝集反應陽性 者，馬、豬重檢仍為可疑，判陰性；重檢仍為可疑者，可判為陽性，或以補體結 合反應核對。.（二）布氏桿菌病平板凝集試驗1. 加血清：取潔凈玻板一塊，用蠟筆劃2）, 并注明被檢血清號碼，以100?成方格（4cmL微量可調加樣器按下列量加被檢血清于方 格內，第1格80?L、第2格40?L、第3格20?L、 第4格10?L。血清用前需放室溫，使其溫度 達20C左右。每一份檢樣需換一個tip頭。 大規模檢疫時，允許只用兩個血清

8、量作試驗, 牛、馬、駱駝用40吐和20?L ；豬、山羊、 綿羊、狗用8(hL和40?Lo2. 加抗原：每格加布氏桿菌病平板凝集抗 原30?L,滴在血清附近，而不與血清接觸。 從血清量最少的一格起，用牙簽將血清與抗 原混勻，一份血清用一根牙簽。抗原用前搖勻，并置室溫使其溫度達20C左 右。3. 作用：混和完畢后，將玻板置恒溫箱中 或采用別的辦法適當加溫，使溫度達到30C 左右，3-5min內記錄反應結果。4. 對照：每次試驗須用標準陽性血清和陰 性血清以及生理鹽水作對照。結果判定：按下列標準記錄反應結果。5 + + + + :出現大的凝集塊，液體完全透 凝 集。明，即100%+:有明顯凝集塊，液

9、體幾乎完全透凝集。明，即75%+ + ：有可見凝集塊，液體不甚透明，即50% 凝集。凝液體混濁，有小的顆粒狀物，即25% + ：集。一：液體均勻混濁，無凝集現象。 平板凝集試驗與試管凝集試驗的關系見6.表1-2 O平板凝集試驗與表1-2試管凝集試驗的關系L 10L L L 80集伽血凝板平1:200相當于試管凝集1:501:251:1007判定標準：同試管凝集試驗。8.注意：對于陽性及可疑的被檢血清需用 試管凝集試驗進行驗證。（三）虎紅平板凝集試驗這種試驗是快速平板凝集試驗。抗原是布氏 桿菌加虎紅制成。虎紅平板凝集試驗可與試.管凝集試驗及補體結合試驗效果相比，具有 操作簡單、快速、特異性強的優

10、點。1被檢血清和布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原各30?L滴于玻璃板的方格內，每份血 清各用一支牙簽或火柴棒混合均勻。在室溫(20C) 4-lOmin內記錄反應結果。同時以 陽、陰性血清作對照。2. 結果判定：在陽性血清及陰性血清試驗 結果正確的前提下，被檢血清出現任何程度 的凝集現象均判為陽性，完全不凝集的判為 陰性，無可疑反應。3. 注意：抗原用前充分搖勻，抗原和被檢 血清用前應放室溫30-60min后再進行試驗。(四) 雞白痢平板凝集試驗1. 被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各1 滴(約30?L)滴于玻板或載玻片上，用牙簽 或火柴棒充分混合。2. 結果判定：在室溫(20C)下，觀察30-60S,

11、 凝集者為陽性，不凝集者為陰性。思考題1. 凝集反應的原理是什么?2哪些因素影響細菌凝集試驗?3凝集試驗中為什么要設陽性、陰性血清 及抗原對照？實驗二 病毒的血凝及血凝抑制試驗有些病毒具有凝集某種（些）動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設 計的試驗稱血球凝集(HA)試驗，以此來推測 被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的， 但病毒的凝集紅細胞的能力可被相應的特 異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗, 具有特異性。通過HA-HI試驗，可用已知血 清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查 被檢血清中的相應抗體和滴定抗體的含量。 目的要求掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作方法，了解

12、其實用價值。材料與試劑1. 96孔形或“V”形微量反應板，50?L 定量移液器，滴頭，微型振蕩器。2. 生理鹽水，0.5%雞紅細胞懸液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗液）, 新城疫陽性血清，被檢雞血清。實驗內容及操作方法試驗（HA）（一）血球凝集孔微量反應板上進行，自左至右1在96?L 生理鹽水。各孔加50 （尿囊液L病毒液于左 側第1孔加50憶2L至第或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50?； 第?L孔，依次倍比稀釋至第11孑L,吸棄50 12 孔為紅細胞對照。雞紅自右至左依次向各孔 加入0. 5% 3.，在振蕩器上振蕩，室溫下靜L?細胞懸液50 O 置后觀察結果（表4T）病毒血凝試驗的

13、操作方法（單位：？L表4T3101112201:10 對 1:512161:321:611:1281:256 靖稀釋 1:2815050505050 生理鹽 5030503050305030 30 褊 5030305030503050300, 5紅細303050503050505050305030304. 結果判定：從靜置后10 min開始觀察結果，待對照孔紅細胞己沉淀即可進行結果觀察。紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網狀，即為100%凝集（+），不凝集者（-）紅細胞沉于孔底呈點狀。.以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血 凝價，即為一個凝集單位。從表4-1看出， 該新城疫病毒液的血凝價為1

14、 ：128,則1:128為1個血凝單位，1:64、1:32分別為2、4 個血凝單位，或將128/4=32,即1:32稀釋 的病毒液為4個血凝單位。(二)血球凝集抑制(HI)試驗1根據HA試驗結果，確定病毒的血凝價, 配制出4個血凝單位的病毒液。2. 在96孔微量反應板上進行，用固定病毒 稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加 50?L生理鹽水。3. 第1孔加被檢雞血清50?L,吹吸混合均 勻，吸50?L至第2孔，依此倍比稀釋至第 10孔，吸棄50?L,稀釋度分別為：1: 2、1:4、 1:8；第12孔加新城疫陽性血清50?L, 作為血清對照。4. 自第1孔至12孔各加50?L 4個血凝單位 的

15、新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新 城疫病毒液對照，振蕩混合均勻，置室溫中 作用lOmin O雞紅細胞0. 5%孔各加12孔至1自第5.室溫下靜置后觀察L,振蕩混合均勻，懸液 50? 4-2）o結果（表（單位：表4-2病毒 血凝抑制試驗的操作方法00 0 0 0 0 0 0OOOOOOOOOOO 豺駅OSOEOE B不 00000000lS0I：IEIS：I96：Ii ：TS：I8ST：II9：ISE：I9I：I8：I WjUJIJjUUJISIXT 0150303010 min室ffl中靜紅0. 55000000000000結果-察6.結果判定：待病毒對照孔（第11孔）出 現紅細胞100%

16、凝集（+）,而血清對照孔（第12孔）為完全不凝集（-）時，即可進 行結果觀察。以100%抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。從表4-2看出，該血清的HI效價為1:64, O 61og2表示，即(-log2)為底的負對數2用以.附錄1阿氏液(Alsever)：即紅細胞保養液氯化鈉0.42g雙蒸水加至 100 ml將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，調整pH 至6. 8, 115C滅菌lOmin, 4C保存備用。2. 0. 5%雞紅細胞制備方法先用滅菌注射器吸取3. 8%枸椽酸鈉溶液 （其量為所需血量的1 / 5）,從雞翅靜脈或心 臟采血至需要血