1、tion of ceriv astatin in mice, rats, and do gs in vivoJ. Dr ug M etab D ispos , 1998, 26(7 640 652.19L indon JC, Nicholson JK, Sidelman U G, et al. Directly coupled HPL C N M R and its application to drug metabolismJ. Dr ug M etab Rev , 1997, 29 705 746. 20Sidemann UG , Braumann U , Hofmann M , et a

2、l. Direct ly coupled 800MHz HPLC N MR spectroscopy of ur ine and its application to the identification of major phasemetabolites o f tolfenamic acidJ. A nal Chem , 1997, 69 607 612.21William JE, Joseph M W, T odd M B, et al. L iquid chro matography /nuclear magnetic resonance spectrosco py and liqui

3、d chr omatog raphy/mass spectrometry identification of novel metabolites of the mult idrug resistance modulator LY 335979in rat bile and human L iver microsomal incu bat ions J. Dr ug metab D isp os , 1998, 26(1 42 51.高效毛細管電泳及其在蛋白質 、 多肽分析中的應用孔 毅 , 吳如金 , 吳梧桐(中國藥科大學 , 江 蘇 南京 210009摘 要 :高效毛細管電泳 (HPCE 是

4、一種分離效率高、 檢測靈敏度高、 樣品用 量少的分析 技術。本文簡 述 HPCE 的 研究進展及基 本原理 , 著重介紹了它在蛋白質及多 肽的分 離、 純 度鑒定、 性 質研究、 結構 分析、 臨床 檢測、 藥代動 力 學研究等方面的應用。關鍵詞 :高效毛細管電泳 ; 蛋白質 ; 多肽中圖分類號 :O658. 9; Q 51 文獻標識碼 :A 文 章編號 :1001-5094(2000 04-0204-05High Performance C apillary Electrophoresis and Its Applicationin Analysis of Protein and Pepti

5、deK ON G Yi, WU Ru jin, WU W u tong(China Phar maceutical University , N anj ing 210009, ChinaAbstract:H ig h performance capillary electrophoresis(HPCE is characterized as an analysis method, w hich show ed high selectiv ity and high sensitivity , but needed only little sample. In this article, the

6、 de velopment of HPCE and its foundamental principle were briefly introduced, and its applications to sepa ration, purity determ ination, characterization study, structural analysis, clinical monitoring and phar macokinetics of protein and peptide were emphasized.Key words:H PCE; protein; peptide蛋白質

7、、 多肽是生命科學中一類重要的生物大 分子物質 , 是生物體實現其功能的物質基礎。在醫 藥領域 , 有許多療效很好的蛋白質、 多肽類藥物 , 如 促紅細胞生成素、 干擾素、 白介素、 重組人生長激素 等都是近年開發的 蛋白質類藥物。在后基因 組時 代 , 蛋白質組學成為一門重要的新興學科 , 其任務就 是研究細胞內所有蛋白質的組成及其活動規律 1。 因此 , 許多研究機構和大財團都在投入人力物力對 蛋白質及多肽進行研究 , 這些復雜的研究工作對分 析手段提出了更高的要求。高效毛細管電泳 (HPCE 是近十幾年發展起來 的一項新的分析技術 , 它將電泳技術和色譜技術結 合 , 是繼高效液相色譜

8、(HPLC 出現之后 , 分析科學 領域的又 一次革命。研究 與實踐表明 HPCE 具有 以下 特點 :分離 效率高 (理論塔 板數 達 106107/ m ; 快速 (2030min 內完成一次 電泳操作 ; 樣品 用量少 (僅為納升級 , 可對單細胞液進行分離分析 ; 靈敏度高 (用激光誘 導熒光 檢測器 , 可達 1 10 24204藥 學 進 展 2000年 第 24卷 第 4期 : :mol 的超低檢測限 2。 Jorg enson 和 Lukacs 研究發 現 , 毛細管的柱效與分子的擴散系數呈反比 , 而蛋白 質、 多肽正具有擴散系數小的特點 , 這意味著毛細管 電泳非常適合于蛋

9、白質及多肽的分析研究。本文就 HPCE 的研究進展及其在蛋白質、 多肽分析中的應 用作一概述。1 HPCE 的研究進展HPCE 是 在 傳統 電 泳的 基 礎 上發 展 起 來的。 1867年 , H jerten 采用內徑 3mm 的石英管 , 內涂甲 基纖維素 , 在旋轉下分離 , 紫外檢測 , 實現了自由區 帶 電 泳 , 這是 毛細 管分 析實 踐的 最初 嘗 試。 1981年 , Jorgenson 和 Lukacs 使用內徑 75 m 的毛細管和 靈敏的熒光檢測器 , 在 +30kV 下電泳分離丹酰化 氨基酸 , 標志著毛細管電泳分析方法的建立。進入 90年代 , 以毛細管區帶電泳

10、 (CZE 、 膠束電動毛細 管 色譜 (MECC 、 毛細管等速電泳 (CITP 、 毛 細管 凝膠電泳 (CGE 、 毛細管等電聚 焦 (CIEF 、 毛細管 電色譜 (CEC 、 非水毛細管電泳 (NACE 、 親合毛細 管電泳 (ACE 等 為代表的 H PCE 分離模式的 發展 拓寬了毛細管電泳的分離能力。運用紫外吸收、 激 光誘導熒 光、 電化 學、 質譜等 檢測手段使 得 H PCE 逐漸成為一種不可替代的分離分析方法 , 確立了其 在分析科學領域的重要地位。最早的商品化毛細管電泳儀誕生在 1989年 3, 之后在短短的 10年中 , 儀器的性能不斷改進 , 自動 化程度不斷提高

11、。現在的 H PCE 儀大都能保 證測 量結果的重現性和高檢測靈敏度 , 其主要生產廠家 有 Beckm an 、 Bio Rad 、 Waters 、 Spectra Physics 等 公 司 , 它由高壓電源、 電極、 檢測器、 毛細管柱系統、 進 樣系統和數據處理系統組成。在 HPCE 中 , 離子或 荷電粒子以電場 (電壓可達 30kV 為驅動力 , 在毛細 管 (內徑 2575 m, 柱長 1475cm 中按淌度或 /和分配系數不同而進行高效分離。目前最常用的分 離模式為 CZE 和 MECC 。CZE, 當毛細管內緩沖溶液 pH 大于 4時 , 柱內 表面因帶負電而吸引緩沖溶液中

12、的正離子 , 形成帶 正電的雙電層。給毛細管兩端加電壓時 , 緩沖溶液 向負極流動 , 形成電滲流 (EOF , 溶液中帶正電粒子 的流動方向與 EOF 方向一致 , 首先流出。中性粒子 隨緩沖溶液流動 , 帶負電粒子的運動方向與 EOF 方 向相反 , 最后流出毛細管。離子遷移的速度還與離 子電荷多少、 離子半徑大小等因素有關 , 稍有差異的 , 離。但是 CZE 對中性粒子不具分離能力。MECC, 在緩沖溶液中加入表面活性劑 , 當表面 活性劑的濃度超過臨界膠團濃度時 , 形成膠束。當 緩沖溶液中加入陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉 時 , 在毛細管中形成帶負電的膠束 , 其在電場中向正 極

13、移動。在中性或堿性條件下 , EOF 速度大于膠束 流速 , 故實際上膠 束的方向與 EOF 的方向 是一致 的 , 待測粒子依據疏水性的不同在水相和膠束相之 間進行多次分配 , 其中疏水性強的中性粒子與膠束 結合牢固 , 洗脫時間長 , 就會與水溶性 中性粒子分 離。在 MECC 中 , 中性粒子的分離機制是它與膠束 間的疏水相互作用 , 而對于帶電離子則有電泳遷移、 靜電作用、 疏水相互作用等多種機制。2 HPCE 在蛋白質 、 多肽分析中的應用2. 1 蛋白質、 多肽的分離蛋白質、 多肽尤其是結構相似的蛋白質、 多肽的 分離是對其進行分析研究的基礎 , H PCE 在蛋白質、 多肽分離中

14、顯示出獨特的優勢 , 目前這一領域的研 究十分活躍。林炳承等 4應用 CZE 在 16分鐘內完 成了九個多肽類組分 (舒緩激肽、 血管緊張肽、 促黑 色素細胞激素、 促甲狀腺激素釋放激素、 促黃體生成 激素釋放激素、 亮內啡肽、 Bombesin 、 蛋白啡肽和催 產素 的分 離 , 分 離 條 件為 :涂層 毛 細 管 28cm 50 m 、 操作電壓 11kV 、 pH 2. 5的 0. 1mol/L 磷酸緩 沖液、 檢測波長 200nm 。 Pessi 等 5采用 CZE 技術 對 MAP 8(PGTH LPALP 2和 MAP 8(PGTH LP SLP 2這兩種結構相似的肽進行分離

15、, 當只用磷酸 緩沖液時不能分開 , 而加入 40%乙腈后則達到完全 分離。不同亞型的免疫球蛋白 G(IgG 在免疫反應 中扮演不同的角色 , Kelly 等 6使用 CZE 分離了不 同亞型的 IgG, 檢測手段為毛細管柱后親和檢測法。 MECC 是 H PCE 中的一種強效分析方法 , 它不僅可 以分 離 帶電 組 分 , 對 不帶 電組 分 也可 實 現分 離 , Yashim a 等 7運用該方法 , 利用含有 SDS(十二烷基 磺酸鈉 或 CTAB (溴棕三 甲銨 的緩 沖 液分 離了 Let13胃動素和 M et13胃動素 , 這種分離在 CZE 中沒能實現。由此看來 , 通過對分

16、離模式的選擇和 分離條件的優化 , H PCE 可對結構相似的蛋白質、 多 肽進行分離。在一般的毛細管電泳介質中加入特殊 添加劑 , 可獲得令人滿意的分離效果 , Rathore 等 8在 50mmol/L 、 pH 2. 5的 磷 酸 鈉 溶 液 中 加 入 20mmol/L CMBCD(羧甲基 環糊精 , 實現了血管 205高效毛細管電泳及其在蛋白質、 多肽分析中的 應用2. 2 蛋白質、 多肽的純度鑒定20世紀末 , 生物制藥業如雨后春筍蓬勃發展 , 許多生物技術藥物已在臨床上發揮重要作用 , 由于 生物藥品所特有的復雜性和質量要求的嚴格性 , 其 純度鑒定需要更強有力的手段。目前 ,

17、常用的純度 鑒定手段有凝膠電泳和 HPLC 。凝膠電泳費時 , 自 動化程度低 , 分辨率差 ; H PLC 則具較高的分辨率 , 檢測靈敏度也有所提高 , 并有自動化程度高等優點 , 因而 , 現在純度鑒定多用 H PLC 法。而與 HPLC 相 比 , HPCE 具有更高的分辨率和靈敏度 , 上樣量也更 少 , 僅為納升級 , 這對珍貴的蛋白質樣品分析非常有 利 , 它是一種靈敏的蛋白質純度鑒定方法。有些純 化的 蛋 白質 在 凝膠 電 泳和 H PLC 上 鑒 定純 度 為 100%, 但用 HPCE 分析時純度僅為 90%5, 也就是 說 H PLC 中的單 峰在 HPCE 中 出現多

18、 個峰 ; 而 用 HPCE 鑒定純度為 100%的樣品 , 經 H PLC 鑒 定其 純度往往也是 100%。在蛋白質、 多肽類藥 物的制 備過程中 , 為優化工藝需對每一步的純度進行測定 , HPCE 快速、 高效的特點則 能滿足此 要求。 Willim 等 9應用 HPCE 對乙肝疫苗的 純化步驟進行 了監 測。人生長激素 (hGH 是一重要的蛋白質類藥物 , 在該產品的研究、 生產和質量控制中 , HPLC 起到了 重要作用。但此蛋白質的少許脫氨基變異很難被檢 測出來 , Frenz 等 10利用 H PCE(CIEF 、 CZE 分析 了 hGH 和脫一個氨基、 脫二個氨基的 hGH

19、, 獲得良 好的分離 , 使純度鑒定結果更為可靠。糖蛋白類藥 物大多是由一組不同糖型的糖蛋白組成 , 糖型不同 , 療效也不同 , 因此在生產過程的質量控制中 , 監測其 不同的糖型很是重要。利用 H PCE 對重組人 紅細 胞生成素 11、 重組人干擾素 7、 酪蛋白糖大肽 12等 糖蛋白的監測也已有報道。2. 3 蛋白質、 多肽的性質研究2. 3. 1 等電點測定 應用 CIEF 技術可準確測定 蛋白質的等電點。先對一系列已知等電點的蛋白進 行電泳 , 用等電點值作 縱坐標 , 相對遷移值作 橫坐 標 , 可得直線 ; 再通過電泳測得 未知物的相對 遷移 值 , 即可求得其等電點。也有報道

20、 , 利用蛋白質通過 檢測窗時的電流值對等電點作圖 , 經測未知物的電 流值求得其等電點 , 這 種方法不需內 標 , 且準 確度 高 , 只有 0. 03個 pH 單位的誤差 13。2. 3. 2 分子量測定 利用 SDS CGE 可以測定糖蛋 白的分子量。由于多糖基團不結合 SDS, 糖蛋白的 質 荷 比較相 應的蛋白 質低。 用經典 的 SDS PAGE 膠上進行分析 , 得到糖蛋白遷移率對數值相對于凝 膠濃度的線性關系圖 (Ferguson 圖 , 該直線的斜率 稱為此蛋白質的排阻系數 Kr, Kr 與蛋白質半徑的 平方成正比 , 而蛋白質的半徑與其分子量的對數成 線性 , 因此推得標

21、準蛋白質分子量的對數相對于 Kr 平方根的線性關系圖 , 故測得糖蛋白的 Kr 值即可 推測其分子量。運用 傳統的 SDS PAGE 電泳需多 次灌膠多次電泳 , 而 CGE 應用溶液狀的分離介質 , 只需對高濃度甲基纖維素的分離溶液進行一系列稀 釋 , 按照設 定的 程序 自動 分析 即可 得到 Ferguson 圖 14。2. 3. 3 穩定性研究 Alex ander 等 7用 M ECC 考 查了 chimeric BR96的熱穩定性 , 對與抗體有關的鏈 和碎片進行了分析 , 輔以基質輔助激光解吸質譜法 , 可對多肽的降解產物進行分析確認。對此 , Hughes 和 Richberg

22、 等 7也進行了研究 , 分離了抗體的重鏈 和輕鏈。蛋白質的折疊及其折疊程度與其功能密切 相關 , 因此研究蛋白質的折疊非常重要。 Slellw agen 等 15以細胞色素 C 為例 , 運用 H PCE 研究了蛋白質 的折疊行為。2. 4 蛋白質、 多肽的結構分析蛋白質、 多肽經酶解后 , 用 HPCE 分離所得 指 紋圖譜 可 提供蛋白 質及多肽 的結構 信息。 Frenz 等 10分別利用 RP H PLC 和 HPCE 對 胰蛋白酶降 解的 rhGH 進 行 分 析 , H PLC 大 約 用 時 150min, HPCE 用時 12min; 在 HPLC 色譜圖中 沒出現的峰 在

23、H PCE 中出 現 了 , 收 集 H PLC 中 的 單 峰 , 再 在 HPCE 中 運行 , 出現了 兩個峰。此研 究結果 表明 , HPCE 是肽圖分析中更有效的工具。蛋白質、 多肽 的氨基酸序列測定往往需酶解或化學降解 , 然后經 HPLC 分離 , 進入氨基酸自動分析儀進行序列測定 ; 而采用 CE, 可快速掃描 RP HPLC 分離后的肽段是 否為純肽段 , 保證了序列測定的準確性。 CE M S 聯 用儀在大型實驗室已被廣泛應用 , 這種聯用技術可 得到產品和消化產品的分子量和特征信息 , 甚至可 以測定蛋白質的一級結構。微量蛋白質 N 端順序測定方法學一個引人注 目的發展便

24、是 CE 技術的應用。該方法所需樣品量 極微 (10nl 或更 低 , 靈敏 度比 HPLC 高 二個 數量 級 , 可在 1 10 6nmol 水平上檢測 PTH (苯乙內酰硫 脲 氨基酸。但目前商業提供的自動蛋白質測序儀 每個循環所產生的 PTH 氨基酸樣品液體積為 100 l 左右 , 這與毛細管進樣量不兼容 , 因而需要研制更加206藥 學 進 展 2000年 第 24卷 第 4期希望的嘗試 , 加拿大 Alberta 大學的研究人員研制的 微型測序儀 , 用注射泵輸送毛細管反應室的試劑 , 不 經任何閥門直接與反應室相連 , 可以精確輸送數微 升的試劑。這種微型測序儀與毛細管電泳聯用

25、的微 量蛋白測序方法已呈現良好前景 16。2. 5 蛋白質、 多肽類藥物的藥代動力學研究蛋白質、 多肽類藥物的藥代動力學是藥代動力 學研究中的難點之一。此類藥物用量小 , 體液濃度 低 , 給檢測帶來困難。另外 , 體液中存在多 種蛋白 質 , 有些蛋白質與藥物結構非常相似 , 更是給分離 帶來困難。 HPCE 具有高的分辯率和靈敏度 , 在蛋 白質、 多肽類藥物的藥代動力學研究中有獨特優勢。 Chen 等 17研究了大 鼠血漿中 D Pen 2, 5腦 啡肽的 HPCE 定量方法 , 由于 D Pen 2, 5腦啡肽紫外吸收很 弱 , 他們采用熒光試劑 TRIT C 對其進行衍生化 , 并

26、對衍生化過程與結果進行了詳盡的研究 ; 經 H PCE 分離 , 并用激光誘導熒光檢測器進行檢測 , 最低檢測 限可達 1 10 18mol, 這種低檢測限滿足了藥代動力 學測定的要求。2. 6 臨床上監測體內蛋白質、 多肽的動態變化 體內蛋白質、 多肽含量的變化與人的疾病密切 相關 , H iraoka 等 18運用 MECC 分析了腦脊液中低 分子 量蛋 白質 M G(Mr 11700 、 T P(Trace pro tein (M r 12300 、 骨磷 脂 堿性 蛋白 (M r 18000 、 TP (Mr 2300030000 和 1酸 性 蛋 白 (Mr 42000 , 并對其中

27、 MG 和 T P 進行了定量測定 , 與 某些疾病的發生進行相關分析。結果表明 , 腦脊液 中 M G 和 T P 的水平隨中樞神經系統病理條件的 變化而變化。3 結 語近幾年 , HPCE 發展迅速 , 儀器愈來愈自動化 , 大多設置了恒溫裝置 , 使其重現性大大提高 , 不僅可 以定性 , 而且能定量。在生命科學領域 , CE 盡顯優 勢 , 應用于蛋白質、 多肽研究的方方面面 , 從簡單的 純度鑒定到復雜 的序列測定。但是 , CE 也有 其缺 陷 , 如 處理樣品少和 不能進行大量 收集 , 而 H PLC 可進行較大規模的制備 , 這兩種技術應取長補短共 同發展 , 而不是相互代替

28、。 CE 與二維電泳 (2D 的 結合 , 有可能大大加速蛋白質組學的研究發展。參考文獻 :1李林 , 吳家睿 , 李伯良 . 蛋 白質組學的 產生及其重 要意義 , 2鄧延倬 , 何金蘭 . 高 效毛細管電泳 M .北京 :科學出 版 社 , 1996.3許旭 . 毛細管電 泳中 半導 體激光 誘導 熒光檢 測、 糖的 分 析和溫度 梯度的研究 R. 大連 :中國科學院大連化學 物 理研究所 , 1998.4林炳承 . 高 效毛細 管電 泳導論 M . 北京 :科 學出 版社 , 1996.5Pessi A, Bianchi E, Chiappinelli L. Applicat ion o

29、f capillary zone electrophoresis to character ization of multiple antigen peptides J. J Chr omatogr , 1991, 557:307 313.6Kelly JA , L ee CS. On line post capillary affinity detect ion of immunoglobulinG subclasses and monoclonal antibody vari ant for capillary electro pho resis J. J Chr omatogr A ,

30、1997, 790:207 214.7Strege M A, L agu AL. M icellar electrokinet ic chromato graphy of protein J .J Chr omatogr A , 1997, 780:285 296.8Ratho re A S, Ho rvath C. Cyclodex trin aided separation of peptides and proteins by capillary zone electrophoresisJ.J Chr omatogr A , 1998, 796:367 373.9Willim MH, W

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32、aration of carbohy dratemediated microheterog eneity of recombinant human ery thropoietin by free solutio n capillar y electrophoresis J. J Chromatogr , 1991, 542:459 471.12Cherkaoui S, Doumenc N , T achon P , et al. Development of a capillary zone electr ophoresis method for caseinoglyco macr opept

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34、in folding ob served by capillary elecyrophor esis in isoelectric buffers J. J Chromatogr A , 1999, 838:131 138.16梁 宋 平 . 世紀 之 交的 蛋 白質 測序 技 術 . 生 命科 學 J. 1999, 11(1 :31 34.17Chen CP, Jeffery D, Jorg enson JW, et al. Sensitive analysis of enkephalin in rat serum by capilary electrophoresis and laser

35、induced fluorecence detectio nJ.J Chromatogr B , 207高效毛細管電泳及其在蛋白質、 多肽分析中的 應用18Hirao ka A, Ar ato T , Pominag a I, et al. Analysis of low molecular mass protein in cerebrospinal fluid by sodium dodecyl sulfate capillary gel electrophoresis J .J Chr o matogr B , 1997, 697:141 147.甲狀腺素與心肌離子通道關系及抗心律失常藥的

36、開發 張廣欽 , 戴德哉(中國藥科大學藥理研究 室 , 江蘇 南京 210009摘 要 :綜述甲狀腺素與心肌離子通道關系 , 包括 其對心 肌細胞 Na +, K +, Ca 2+通道 的動力學 影響。提 示 , 甲 狀 腺素急性給藥對離子通 道的調控 是通 過作 用于 細胞 核外 機制 , 慢 性給 藥是 通過 作 用于 細胞 核內 受體 蛋白 , 增 加 DNA 的轉錄。指出阻斷多種離子通道應成為開發抗心律失常藥的主要方向 , 簡介抗心律失常藥的開發近況。 關鍵詞 :甲狀腺素 ; 心肌離子通道 ; 抗心律失常藥中圖分類號 :R977. 1+4; R972+. 2 文獻標識碼 :A 文章編號

37、 :1001-5094(2000 04-0208-04The Relation of Thyroid Hormone to Ion C hannels in Cardiac Myocytesand Development of Antiarrhythmic Dru gsZHA NG Guang qin, DA I De zai(Research Division of Phar macology , China Phar maceutical Univer sity , N anj ing 210009, ChinaAbstract:In this article, the relation of thyroid hormone to ion channels in ca