1、分子生物學技術近年來，心血管疾病的發病率和死亡率急劇增加，已成為危害我國人民群眾 生命和健康的重大疾病。人們逐漸認識到，包括心血管疾病在內的許多疾病的生 理、病理機制的本質問題是相關基因的表達及其調控。隨著研究的深入，心血管疾病的研究已深入到分子生物學水平。人們尋找疾病相關基因，研究其表達調控 機制，希望在分子水平闡明疾病發生機制，以期更有效地進行疾病的診斷、治 療。相應地，很多分子生物學研究技術也應用到對心血管疾病的研究中來，成為不可或缺的基本手段,如分子雜交技術、聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction, PCR)技術、反義核酸技術、DNA微陣列、轉基因技術等等。分

2、子診 斷學是以分子生物學理論為基礎，利用分子生物學的技術和方法研究人體內源性 或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結構或表達調控的變化，為疾病的預 防、預測、診斷、治療和轉歸提供信息和決策依據的一門學科。1953年Watson& Crich發現DNA雙螺旋結構，標志著分子生物學時代的到來。隨著研究的進 展，人們對心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平,很多分子生物學的研究技術也在疾病機理、藥物機理的研究中廣泛應用，成為基本的研究手段。人類基 因組計劃完成后，生命科學研究進入后基因組時代，進行功能基因組學、蛋白質 組學的研究，相應的實驗技術也廣泛應用并不斷發展。在過去的短短的10余年中，

3、檢驗醫學發展日新月異、發展迅猛，臨床實驗室 的實驗設備已高度自動化及網絡化，”實驗室全自動化" (Total LaboratoryAutomation,TLA)、分子診斷(MolecularDiagnostics)、床旁檢驗(Point of Care Tests,POC!)、循證檢驗醫學(Evidence basedlaboratory medicine,EBLM 的興起 為心血管疾病的診療提供了極大幫助。一、分子生物學技術由于分子生物學技術的快速發展，以及人類基因組序列認識的逐漸完善，以PCR為代表的體外核酸擴增技術已在臨床基因診斷中得以較為廣泛的應用，如病毒、細菌的基因快速檢測

4、，遺傳性疾病的診斷，月中瘤的基因診斷等。實時熒光定量 PCR技術的應用，不僅使臨床基因檢測更加快速，而且使基因檢測進入定量階段， 這特別有利于某些疾病治療效果的評價。免疫檢驗中的放射免疫分析 (Radioimmunoassay RIA)，酶免疫分析(Enzyme Iimrrmnoassay, EIA)，金標 記免疫分析，熒光免疫分析(Fluoroimmunoassay, FIA),時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved Fluoroimmunoassay, TRFIA )，化學發光免疫分析 (Chemiluminescence Immunoassay, CLIA )，電化學發光免疫分

5、析 (Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)技術的臨床應用不僅拓寬了 免疫學檢測的領域，同時提高了免疫學檢測的靈敏度，促進了免疫檢測的自動化。 特別是化學發光免疫分析、電化學發光免疫分析技術的誕生，使得免疫學檢驗進 入了一個新的時代，檢測靈敏度可達pg水平，具檢測速度、分析自動化程度及分 析準確性也是其它免疫學方法無法比擬的。 流式細胞術進入臨床實驗室極大地拓 寬了臨床檢驗的范圍，可應用于細胞DNA、RNA定量及細胞周期分析、細胞表 面標志物分析、凋亡細胞的檢測等，促進了細胞生物學的臨床應用。生物芯片技術是生命科學研究中繼基因克隆技術、基因自動

6、測序技術、PCR 技術后的又一次革命性技術突破。生物芯片已在高通量基因測序、基因表達研究已經發揮了其重要作用，也將在后基因組時代研究蛋白質功能及蛋白質間的相互 作用方面發揮其極其重要的作用。由于生物芯片具有高通量、可同時快速檢測多 種待檢分子的特點，故研究適用于臨床實驗診斷需要的低密度生物芯片近年來已 成為檢驗醫學的研究熱點之一，用于肝炎病毒、HPV檢測及分型、結核分枝桿菌、 人巨細胞病毒、幽門螺桿菌、地中海貧血、性傳播性疾病等的檢測及診斷的基因 芯片已相繼問世；用于微量蛋白質、激素、月中瘤標志物監測的蛋白質芯片也已得 到初步應用。分子診斷就是利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測

7、基因結構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。分子診斷以基因作為 檢查材料和探查目標，屬于“病因診斷”針對性強。目前已經能夠進行分子診斷 的疾病包括：染色體疾病的診斷和產前篩查。單基因遺傳病的分子診斷和產 前診斷。單基因遺傳疾病是由單個基因發生突變引起的疾病。已發現的人類單基因遺傳病多達400種以上。目前，已經了解許多單基因遺傳疾病的致病基因以及 發病機制，如Marfan綜合征、先天性腎上腺皮質增生癥、糖原累積癥、家族性高 膽固醇血癥。多基因疾病的分子診斷。多基因疾病是危害人類健康的多發病、 常見病，如惡性月中瘤、心血管疾病（動脈粥樣硬化、高血壓等）、糖尿病、精神- 心理疾病（精神分

8、裂癥、憂郁癥等）。這些疾病的分子病因十分復雜，可采用已知 基因標志的連鎖分析和關聯分析方法，對未患病個體進行患病危險性預測，以及 對上述疾病進行亞型的基因分型和鑒定等輔助診斷，以利于疾病的正確治療。 感染性疾病的基因診斷。惡性月中瘤的分子診斷。二、心血管疾病檢測常用的分子生物學技術心血管疾病是一種與多基因有關的復雜疾病，具發生、發展與多基因位點變 異及表達異常有關。高血壓、冠心病等心血管疾病，是由于環境與遺傳因素相互 作用引起，涉及多基因的參與，機制復雜，分離與克隆相關基因是了解這些疾 病機理的基礎。研究相關細胞和組織在生理、病理或藥物處理狀態下的基因表達 譜，分析基因表達差異，可以為篩選疾病

9、候選基因，闡釋疾病的機理提供重要 信息。分子診斷的常用技術方法有：核酸分子雜交技術，包括 Southern印跡（Southern blot雜交）,Northern ER跡（Northern blot 雜交）,斑點雜交（dot blot）, 原位雜交（insituhybridization）等；PCR及相關應用技術，包括等位基因特異 寡核甘酸探針（Allele Specific Oligoneucliotides, ASO）雜交法、單鏈構象多態（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）分析、DNA 限制性片段長 度多態性（Restriction

10、fragment Length Polymorphism, RFLP）分析、微衛星 DNA分析技術等。基因測序是基因突變檢測的最直接最準確的方法它不僅可確定突 變的部位還可確定突變的性質。基因組學及分析技術，包括基因芯片、DNA微陣列(DNA microarray)技術等，利用核酸分子雜交原理，可用于大規模篩選 和基因表達研究。蛋白質組學及分析技術，作為功能基因組研究的重要支柱， 研究的是在不同時間和空間發揮功能的特定蛋白質群體，從而揭示和說明生命活動的基本規律。熒光原位雜交染色體分析技術(FISH),這項實用技術不僅可 用于基因在染色體上的定位研究，而且可直接用于實驗室診斷。波譜核型分析 技

11、術(Spectral karyotyping, SKY)主要用于月中瘤細胞的遺傳學分析，檢測復雜 的細胞遺傳學異常，也可用于比較細胞遺傳學的種間進化差異性研究等方面。 分子生物學相關技術的發展及作用，其中應用較多的有：一是毛細管電泳技術(capillary electrophoresis CE)現已廣泛應用于病原體、月中瘤和遺傳病的基因診 斷，如病原體特異基因檢測、基因突變檢測、序列分析等；二是液質聯用質譜技 術(LC/MS/MS),可在短時間內通過檢測血液中氨基酸或酰基肉堿水平異常可 快速篩選出近30種基因遺傳性代謝紊亂疾病在多肽、激素、寡核甘酸以及藥物 成分分析等方面應用廣泛；三是變性高效

12、液相色譜技術，可自動檢測單堿基替代 及小片段核甘酸的插人或缺失。(一)DNA 微陣列(DNA microarrays )DNA微陣列(DNA microarrays)廣泛應用于基因的序列分析、基因組圖譜 分析、基因突變與基因多態性分析以及疾病的基因診斷等方面。1999年基因微陣列技術應用于心血管系統的研究以來，在心血管病相關基因差異表達分析、疾 病分子分型、基因突變檢測和多態性分析等方面取得了一些進展。DNA微陣列也叫DNA芯片、基因芯片(genechip),將數以萬計的DNA探 針固化于支持物表面上，產生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交， 通過檢測雜交信號來實現對生物樣品快速、并

13、行、高效的檢測或醫學診斷。由于 常用硅芯片作為固相支持物，運用了計算機芯片的制備技術，所以稱之為基因微 陣列或基因芯片技術。其基本原理是分子雜交，類似于Southern和Northern印跡 雜交技術，通過探針與固定于芯片上的大量cDNA、表達序列標簽(ExpressedSequence Tags EST)或寡核甘酸的雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣 品中靶分子的數量，具有高通量、簡便、微縮、集約化、平行化等優點。基因表達譜芯片和基因診斷芯片是基因芯片的兩種重要形式 ，前者可以提供 待測組織的基因表達譜，即組織中基因整體的表達情況；后者則主要是通過檢測 疾病相關基因突變或者表達改變等信號

14、來診斷疾病的發生。人類共有35000多個基因，2001年哈佛大學附屬醫院心血管研究中心用 3種 統計方法確定了 26000多個與人類心血管系統有關的基因，結果表明與人類心血 管系統有關的基因占人體基因的 3/4,這也是全世界第一次建立這樣的基因庫。并確定了 200多個與心功能衰竭有關系的病態基因。心血管系統生理功能和病理改 變的分子機制十分復雜，與心血管系統生理和病理過程相關的信號轉導系統也是 一個綜合的調控網絡，其狀態的描述是傳統的單因素研究理論和方法所不能承擔的,需要借助復雜系統的研究理論和方法來完成。而以往對心血管疾病的研究，都是采取一種疾病用一個基因檢測的傳統方法，存在諸多不便，不能滿

15、足當前醫學領域飛速發展的需求。而微陣列芯片利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核甘酸微陣列，使大規模、高通量同時檢測成千上萬種組織或細胞內的基因的表達 成為可能，達到了一定意義上的全基因表達譜的檢測。EST是長150500bp的基 因表達序列片段,EST技術是將mRNA反轉錄成cDNA并克隆到載體構建成 cDNA文庫后，大規模隨機挑選cDNA克隆，對其5或3端進行一步法測序,所獲 序列與基因數據庫已知序列比較，從而獲得對生物體生長發育、繁殖分化、遺傳 變異、衰老死亡等一系列生命過程認識的信息。心血管系統基因組DNA數目龐大,含有重復序列和非編碼序列，如完全采用克隆篩選和排列的方法獲得其編碼

16、基因序列，大量的時間和精力將被消耗在模板DNA的制備上。因此采用此技術在短期內即得到大量來自cDNA文庫的表達序列，即表達標簽序列（ESTS），將 其制備成ESTs微陣列是目前尋找和發現新基因及心血管疾病相關基因的快速有 效方法。目前，在心臟的研究中，微陣列芯片技術主要用于檢測心肌重塑模型 （包括缺 血損傷、擬神經遞質/激素刺激造成的心肌重塑和不同發育階段的心肌重塑等模 型）的基因表達譜、病毒性心肌炎的針對治療及心血管疾病的基因表達差異與病 理狀態下分子機制的研究等方面。DNA微陣列技術近年被應用于冠狀動脈疾病、心肌梗死、心衰和一些先天 性心臟病的研究中，用來比較患者的基因表達差異，也用于研究

17、內皮細胞、血管 平滑肌細胞、免疫細胞在心肌梗死、冠狀動脈疾病中的變化。（二）基因表達序列分析 （Serial Analysis of Gene Expression, SAGESAGE技術最初由 Velculescu等人建立，與微陣列技術一樣，SAGE技術 可同時掃描上千個基因的表達，可獲得完整的轉錄譜，是一個非常有效的分析 基因表達的方法。SAGE技術基本原理是，在一個基因轉錄本內部特定位置上，有能代表一 個基因的短序列標簽，多個SAGE標簽連結在一起，連到克隆載體上，測序。 每個SAGE標簽理論上代表一個轉錄本，基因表達差異可以通過比較特定SAGE標簽在不同文庫間表達豐度的差異來表示。相對

18、于微陣列技術,SAGE在心血管疾病研究中的應用還是較為有限。目前，正常人心臟的 SAGE文庫已經建立，也有報道建立了正常鼠心臟 的基因表達譜。在心血管發育、動脈粥樣硬化、脂代謝調節等許多領域都可應用 SAGE技術。在Schwartz等的研究中，利用SAGE技術識別鼠心臟血管緊張 素H （ANGH）調節靶位點，發現了一些新的 ANGII調節靶位點。（三）代表性差異分析 （representational difference analysis of cDNA, cDNA RDA） Hubank等1994年建立cDNA RDA 技術。之后 cDAN RDA 被廣泛應用 于各個領域的基因克隆，如月中

19、瘤特異基因、分化相關基因、器官特異基因、刺激 信號誘導表達基因等。這項技術的原理為：用識別4個堿基的限制性內切酶對雙 鏈cDNA進行消化，理論上將產生平均大小為256bp的DNA片段，因此細胞中 絕大多數表達的基因至少有兩個酶切位點，即產生一個兩端帶有可識別和處理 的末端片段，可以進行后續的擴增、消減、富集等操作。在對心血管疾病的研究中，如內皮細胞，動脈硬化斑塊等，也有RDA技術 的應用。Tyson等應用RDA方法研究正常人和動脈粥樣硬化患者血管中基因表 達差異，發現了包括炎癥反應、免疫反應的相關基因在內的31個差異表達的基因，為粥樣硬化形成機理的免疫反應學說提供證據。（四）蛋白質組學方法蛋白

20、質組（proteome指一個細胞或一種組織基因組所表達的全部蛋白質。 是由 Wilkins在1994年首先提出，并于1995年首次在文獻中闡述。蛋白質 組學方法是通過對比正常細胞與不同處理條件下的細胞或疾病細胞蛋白質表達 譜的不同，發現不同情況下蛋白質表達的變化，是一種在蛋白質水平的差異顯 示。該技術基本方法為：樣品制備；蛋白質的分離，常用分離方法有雙向 凝膠電泳（2- DE）、離子交換、分子篩法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電 泳、質譜（MS）等技術；蛋白質成像；蛋白質的鑒定：在分離及檢測之后， 要進行蛋白質鑒定。蛋白質組學技術在心血管疾病研究中廣泛應用。 研究者已在心血管蛋白質組 研

21、究中識別了能量代謝相關蛋白、 細胞骨架蛋白、熱休克蛋白等多種蛋白質的變 化。在擴張型心肌病的分子機制方面，已發現近100種心肌在擴張型心肌病的 心肌中蛋白質明顯減少，大致分為三類：細胞骨架及肌纖維蛋白，與線粒體及 能量產生相關的蛋白，與應激反應相關蛋白。在對心血管疾病中平滑肌細胞機能紊亂的研究中，也有蛋白質組學方法的應用。Dupont等用2- D方法研究動脈平滑肌細胞，發現患者中有83個細胞內 蛋白、18個分泌蛋白表達不同。Mayr等應用2- D與MS研究PKC delta對 血管平滑肌細胞的作用，結果PKC缺少的細胞中有 30種以上的蛋白質改變， 包括涉及葡萄糖代謝、脂代謝的酶，及谷光甘肽循

22、環、細胞骨架相關蛋白。證明 PKC delta在葡萄糖代謝、脂代謝、控制細胞氧化還原態、SMC細胞分化的過程中是關鍵調節因素。在基因表達分析方法中，沒有一種方法能夠適合于所有要研究的問題 ，需 要根據所研究問題的特點，選擇不同的方法，也可以將幾種方法結合使用。上文 中的幾種技術都有自己的缺點，包括成本問題、靈敏度問題、操作復雜等。具體 實驗中還需根據不同目的、不同實驗許可條件進行選擇。另外，新技術的出現往 往會帶來科學研究的巨大進展，PCR技術就是一個很好的例證，因此，發展新 技術也是科學研究中一個不可忽視的重要方向。（五）第二代測序技術的發展隨著二十世紀中期DNA雙螺旋結構的發現，至今生命科

23、學可謂是在半個世紀的時間里進行了迅猛的發展，人類對自己的機體了解程度越來越深刻，對于 疾病的認識需求也越來越迫切，利用遺傳信息來了解疾病，更是從源頭來了解 疾病本身，并由此延伸出多個學科。進行基因組學研究最基礎的技術手段是 DNA 測序技術，在雙螺旋結構發現后，科學家迅速展開了對測序技術的研究，第一 代測序就是在這樣的背景下出現的，上個世紀七十年代先后出現了兩種測序技 術，產生了劃時代的影響，其中一種是至今為止還在使用并且做出突出貢獻的 sanger測序法，是由Frederick Sanger發明的，稱為雙脫氧鏈終止測序法。另外一種是化學講解法，由 Walter Gilbert 發明。雖然第一

24、代測序在發明之 后的時間里為人類基因組學研究貢獻了不可磨滅的貢獻，完成了很多相關基因 組學研究工作，其中規模龐大人類基因組計劃( HumarGenome°roject , HGP, 前后跨越兩個世紀，將近13年時間，耗費30億美元，集中了全球最頂尖的 生物學專家，僅僅是完成了單個人體的基因組圖譜。由此可以看出，第一代測 序存在著耗時長、耗費大等問題，不適合大規模應用于人類疾病的基因組學研 究。進入二H一世紀之后第二代測序技術(Next Generation Sequencing , NGS得到飛速發展，盡管NGS在2004年才開始得到商業應用，但是它已經有能力 影響到我們對全基因組生

25、物學問題的探索，并且在短短的幾年時間，已經有超 過100項關于NGS的技術平臺被開發出來，這些技術不僅僅耗時短、耗費低、 通量高，而且也加速促進人類對測序數據讀取的多樣性需求，使DNA測序技術大規模應用人類疾病研究成為了可能，因此NGS完全徹底地改變了我們對基因 組學的研究，開放了許多新的研究領域，包括始祖基因的探索、生物多樣性的 特征描述以及復雜疾病未知病因的識別等等，并且隨著NGS的迅猛發展，與此相關的生物信息學技術也隨之快速發展。經過幾年的發展，目前應用于大規模并行測序的主流平臺主要包括：Roche公司的 454 FLX、Illumina 公司的 Solexa Genome Analyz

26、er/HiSeq System 和 美國應用生物系統公司the Applied Biosystems SOLiDTM System 。這三家公司 研發的NGS平臺代表了目前高通量測序技術水平，也是應用最為廣泛的主流平 臺。如表1-1所示，這三種技術有著各自的特點。表1-1第二代測序技術的比較Table 1-1 Comparison of Next-Generation Sequencing Systems.測序平臺 測序原理 讀長 精確度測定序列輸出數據量時間454 FLX焦磷酸測序700bp99.9% 1M 0.7Gb24 小時3G600Gb310 天50bp(SE)Solexa 邊合成邊測

27、序 50bp(PE) 98%100(PE) 50+35 ?bp or7 天(SE)SOLiD 連接法測序99.9%1200M120Gb50+50fbp14 天(PE)注：SE=Single-end; Paired-end=PE; bp=base pair作為第一個商業化應用的第二代測序平臺，Roche公司的454 FLX系統采用的是焦磷酸測序技術。其基本原理是：在每一輪的核甘酸合成中通過加入DNA聚合酶導致焦磷酸鹽的釋放，從而引起一系列的下游反應，最終依靠熒光素酶等 生物酶產生可捕捉的光學信號。具體過程如圖1-1所示。從圖1和表1我們可以看出，焦磷酸測序技術的特點是：它的讀長可以達到700bp

28、,準確率為99.9%,并且24小時內就可以完成0.7Gb的數據輸出量，最突出的優點就是速 度和核酸讀取長度，但是數據產出量與另外兩種測序平臺相比較少，并且高額的費用也是454平臺廣泛使用的一個挑戰。國1-1焦磷酸測序技術原理DNA library prtpAritlongDlNA Genome fragmented by rtebulizaTiorNo cloning： no celery pickingsstDNA library created with achptcrf“VB fragmenti select ed using avidin-biotin punftcatlonsstDN

29、A libraryFNGS還可以應用于月中瘤標志物的檢測、感染性疾病的診斷及耐藥性檢測。目 前已經應用于醫學臨床檢測的項目包括：遺傳性月中瘤易感基因檢測、個體化用藥指導、無創產前DNA檢測、新生兒遺傳代謝病篩查以及單基因遺傳病檢測等。 1997年牛津大學的研究團隊首次從孕婦血漿中提取到胎兒DNA并應用于性別診斷。DNA測序技術發展至今，針對胎兒利用 NGS進行無創產前診斷技術已經 成功應用于臨床，降低了不良胎兒的出生率。對于乳腺癌患者來說，如果能夠在 發病早期通過NGS檢測到BRCA基因高表達，就可以及時給與干預，甚至使患 者得到治愈的機會，Feliubadal 6的研究團隊已經證實BRCA基

30、因的突變會導致 乳腺癌的發生，也是目前較為準確的 NGS預測疾病發生的應用之一。曾經造成 較為嚴重公共衛生問題的 H7N9流感病毒是由中國衛生部病原體系統生物學重 點實驗室研究人員通過NGS技術鑒定發現的。靶基因治療藥物注射用曲妥珠單 抗，又名赫賽汀，已經成為人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowthfactor receptor-2, HER2過度表達的轉移性乳腺癌的一線用藥，并且逐步開展 的臨床試驗表明在許多上皮性月中瘤中，如果HER2表達過高，赫賽汀是適用的，可以有效提高患者的生存率。三、分子生物學技術在心血管疾病中的應用（一）在篩查心血管疾病中的應用基因篩查并非

31、金標準，發現突變并不能完全預測、預后或確診，因為有些致 病余田攜帶者可能終生不發病尤其是錯義突變，需要進一步進行功能研究。但是基因篩查相對于臨床診斷有很好的時效性，可以在發病前或在出現嚴重臨床事件前 及時采取相應的預防措施，降低猝死率。每一種檢查都有一定的特異度和靈敏度， 不能將各種疾病不完全外顯造成假陽性而完全否定基因診斷的前景，存在致病基因突變有進一步發展致病的易感性，因此對于這部分病人建議進行跟蹤隨訪。 盡管目前研究還不能明確肯定特定基因突變對患者臨床及預后的價值，但基因篩查對心血管患者的診斷和臨床治療仍具有不可估量的意義。應用分子診斷技術進行疾病篩查，可以實現目前的診斷一一治療模式，

32、轉向 預測一一預防及個體化模式。應用分子診斷技術，可對部分心血管疾病進行篩查。 青少年猝死的常見原因為肥厚型心肌病。 深入了解肥厚型心肌病的遺傳基礎對理 解這種最常見的心血管遺傳疾病及給予最適合的處理具有重要意義。肥厚型心肌病發病涉及的基因有很多種，每種基因的突變部位又分布在不同的外顯子及內含 子上，因此，對肥厚型心肌病進行人群篩選必須尋找一種經濟方便的方法。應用分子診斷技術進行基因篩查改變了傳統的肥厚性心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM ）診斷方法，患者可以不依賴心室肥厚，而在發病以前就 可以得到診斷（臨床前診斷）。2010年Voelkerding等人報

33、道：應用新一代測序 技術（Next generation sequencing NGS）為肥厚性心肌病的篩查及診斷提供了 新方法。學者們用長片段PCR技術擴增HCM中的基因片段，發現Myosin , heavy chain 6、7 （MYH6、7）、Myosin, light chain 2、3 （MYL2、3）等 16 個基因中 共有個突變點可以用來篩查HCM,提高了疾病篩查的敏感性。現在的研究也表明，致心律失常性右室心肌病（Arrhythmogenic RightVentricular Cardiomyopathy, ARVC）是一種橋粒病橋粒功能異常是致病的最后 通路，非橋粒基因可能通過

34、影響橋粒發揮作用，而非橋粒基因迄今為止發現的家系及突變數目有限，因此建議先篩查橋粒成分基因，可對ARVC進行篩查。2013 年Campuzano等人針對家族中有成員發生心臟性猝死的15個西班牙家族進行基因檢測及全身體格檢查后發現 DSP-p.Q986X的遺傳變異對致心律失常性右室心 肌病的發生具有預示意義。對于原發性高血壓，盡管沒有一個研究能夠明確的易 感基因但是針對多個基因的多個單核甘酸多態性進行篩查分析，可以實現在分子生物水平預防和治療原發性高血壓。（二）在診斷心血管疾病中的應用對不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略以求達到最佳的診斷效能。目前分子診斷技術對于心血管疾病的基因診斷，主要應用

35、于以下幾個方面： 1.免疫法檢測轉錄因子免疫法檢測轉錄因子是將預先制備好的與相應轉錄因子特異結合的雙鏈 DNA通過核酸粘附液包被于酶鏈板孔中，與待測樣品充分反應后，進行相應轉 錄因子的免疫反應及顯色反應，從而達到檢測核轉錄因子活性的目的。 本項分子 診斷技術中DNA的包被不需特殊的預活化試劑和特殊的表面，具有包被省時、 檢測過程簡便、無需特殊的儀器設備、適合作高通量檢測、無放射性污染、靈敏 度高和定量準確等優點。與心臟發育、生長相關的遺傳因素可直接導致許多心臟疾病的形成。轉錄因 子Nkx2.5是心臟前體細胞分化的最早期標志之一， 與心臟發育密切相關，Nkx2.5 基因突變導致先天性心臟病的發生

36、。2013年Huang通過免疫法和基因及基因功 能分析發現，轉錄因子 Nkx2.5基因上游增強子的兩個雜合 DNA變異序列對小 部分室間隔缺損的先天性心臟病發揮作用，通過這樣的遺傳研究能為先心病的治 療提供策略。2 .聚合酶鏈反應法檢測外顯因子PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技 術之一。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或 DNA片段，并能輕易在皮克 (pg)水平起始DNA昆合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個 領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核甘酸序列分析，還可以用

37、于突變體 和重組體的構建基因表達調控的研究， 基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診 斷等諸多方面。GATA-4基因與先天性心臟病關系密切在心臟的發育過程中發揮著重要作 用，它的單個或多個基因的突變及異常表達均可能會導致心臟畸形的發生，如房間隔缺損、法洛四聯癥、室間隔缺損等，應用 PC曲術對血7標本中GATA-4基 因3, 4, 5, 6外顯子對引物進行PCR檢測，擴增產物進行瓊脂糖凝膠中電泳， 可進行定性定量分析，即可對冠心病(Coronary Heart Disease CHD)進行診斷。 另外，2013年最新研究發現，Wei等人通過PCR技術發現GATA-5基因中有兩 個雜合突變位點p.R

38、187G和p.H207R,均可導致法洛四聯癥的發生，并為人法洛 四聯癥的早期預防和等位基因治療法提供策略。3 .基因單核甘酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)檢測SNP是一種最常見的可遺傳變異，可分為兩種形式，一是基因編碼區的SNP, 稱為cSNP;二是遍布于基因組的大量單堿基變異，已廣泛地應用于疾病的連鎖 分析及關聯分析、月中瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機制研究、個性化用藥研究 等諸多領域。例如ARVC可以對PKP-2、TGFB-3和DSP等相關突變基因進行單 核甘酸多態性檢測，分析基因型的差異，以探討其基因多態性與疾病的相關性。 也可以將檢測結

39、果通過與人類基因組序列多態性數據庫(dbSNP)進行序列比較，選擇相應的多態性位點并在家系其他成員中進行序列測定和比較分析，可得出相應的結論。4 .基因突變檢測根據心血管疾病相關的目標基因，提取病人基因組DNA,可應用基因擴增和單鏈構象多態分析(PCR-SSCP)等分析技術，與正常對照組比較，即可對突 變基因進行檢測。同時，還可將擴增產物上高效液相色譜技術( Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)進行分析，與正常組比較，分析 其差異性，只要存在差異便可認為有異常。PCR-SSCP是在不測序情況下檢測核 酸變異的敏感方法

40、。SSCP突變檢出敏感性35%100%不等，當DNA片段長度 在300bp以內時，SSCP分析檢測基因突變的準確性為 90%100%。采用SSCP 分析與毛細管電泳方法相結合技術，結果可使基因突變的檢出敏感性達100%,并具有高通量檢測的優點。例如，對先天性長QT綜合征(CLQTS),可對其中的LQT1-3 (KCNQ1、KC-NH2、SCN5A)等相關突變基因進行檢測，分析基因型的差異，即可對這種遺傳學心肌病進行診斷。5 .致病基因DNA測序DNA測序技術使直接檢測核甘酸突變成為可能，而不僅僅是基因片段的多 態性分析使臨床分子診斷更加精確。 常用于探針設計、特異引物合成、基因結構 分析等，在

41、遺傳病診斷、微生物種屬鑒定、月中瘤診斷等領域廣泛應用，人類基因 組計劃就是由于大規模自動化測序技術的發展而順利完成的。但由于DNA測序方法復雜一般臨床實驗室無法進行，有必要時可委托有條件的公司或研究機構進 行。各種基因序列可由 Genbank上獲得，根據基因序列設計特異性引物，進行 基因擴增，擴增產物可以進行測序檢測，通過與人類基因組序列數據庫( Build 36.3)進行序列比較也可將測序結果與正常序列進行比對即可得出結果。目前大 部分遺傳性高血壓的基因診斷多依賴于直接的DNAW序技術，通過對致病基因的序列分析，可發現導致基因功能異常的各種形式的突變。6 . DNA甲基化檢測很多研究顯示，基

42、因表觀遺傳學的改變與動脈粥樣硬化有著密切的關系，例 如誘導同型半胱氨酸含量升高，可以改變人血管平滑肌細胞DNA甲基化的改變， 從而導致動脈粥樣硬化的發生，異常的 DNA甲基化使血管平滑肌細胞增殖，并 從中膜遷移至內膜參與形成動脈粥樣硬化斑塊。 除全基因組甲基化的變化與冠心 病相關，一些特異性的基因甲基化也影響動脈粥樣硬化的進展，如雌激素受體基因、P53基因、細胞外超氧化物歧化酶基因等。通過對動脈粥樣硬化相關的DNA甲基化水平進行檢測，即可了解動脈粥樣硬化的進程。常用的甲基化檢測方法有： 限制性內切酶法、亞硫酸氫鹽處理法和 DNA芯片技術等。同樣的方法可以應用 于原發性高血壓的診斷。7 . miRNA 檢測miRNA參與調控動脈粥樣硬化相關因素，包括內皮細胞的生長、分化、死 亡和凋亡，以及內皮祖細胞、炎癥細胞、細胞因子、脂質的調節等，從而促進動 脈粥樣硬化的發生發展。對相關的miRNA進行檢測，可對動脈粥樣硬化的發生、 發展及預后進行診斷，目前國內外miRNA檢測方法主要有：miR