1、【目的】學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理。測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。運用運用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。 【原理】 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使蛋白樣品與），使蛋白樣品與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，由于復(fù)合物結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，由于復(fù)合物分子量的不同，在電泳中反應(yīng)出不同的遷移率。分子量的不同，在電泳中反應(yīng)出不同的遷移率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出

2、的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出被測蛋白樣品分子量的近似值。線，推算出被測蛋白樣品分子量的近似值。 在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的分子大小在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率有和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率有差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（基硫酸鈉（SDS），形成蛋白質(zhì)），形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，這種復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合了大量的復(fù)合物由于結(jié)合了大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離的電荷狀態(tài)，形成了僅

3、保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然的電荷差異，此時，蛋白質(zhì)分子的的電荷差異，此時，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決電泳遷移率主要取決于它的分子量大小于它的分子量大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。乎可以忽略不計。 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品帶孔膠 按分子大小分離電泳方向 電泳 小分子大分子夾在兩塊玻璃板之間的凝膠 電泳緩沖液 電泳緩沖液 加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源

4、 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時，之間時，電泳遷移率與分子量的自然對數(shù)值呈反比，符合下列方電泳遷移率與分子量的自然對數(shù)值呈反比，符合下列方程：程： lnMr =bmR+K 式中：式中：Mr為蛋白質(zhì)分子量，為蛋白質(zhì)分子量，mR為相對遷移率，為相對遷移率，b為斜為斜率，率，K為截距。在條件一定時，為截距。在條件一定時，b 和和K均為常數(shù)。均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在

5、標(biāo)準(zhǔn)曲同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。線上求得分子量。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。 相對遷移率【實驗器材】直流穩(wěn)壓電泳儀直流穩(wěn)壓電泳儀垂直平板電泳槽垂直平板電泳槽移液器移液器微量注射器微量注射器燒杯、試管、滴管、培養(yǎng)皿、直尺等燒杯、試管、滴管、培養(yǎng)皿、直尺等【實驗試劑】凝膠貯備液凝膠貯備液分離膠緩沖液分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液10%SDS2倍還原緩沖液倍還原緩沖液【實驗試劑】電極緩沖液電極緩沖液10%過硫酸銨過硫酸銨染色液染色液脫色液脫色液【實驗試

6、劑】低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B Mr=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 Mr=66,200 兔肌動蛋白兔肌動蛋白 Mr=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 Mr=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 Mr=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 Mr=14,400一、裝板一、裝板 將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個槽中，形成一個“夾心夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠

7、模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，灌注膠液。灌注膠液。【操作方法】二、分離膠的配制（二、分離膠的配制（12%）試劑試劑 體積體積 H2O3.35（ml）凝膠貯備液凝膠貯備液2.5（ml）分離膠緩沖液分離膠緩沖液(pH8.8)2.5（ml）10% SDS 0.1（ml）TEMED 5（ul）10%過硫酸銨過硫酸銨 50（ul）總體積總體積10（ml）三、分離膠的灌注和聚合三、分離膠的灌注和聚合 用移液管將所配制的分離膠緩沖液用移液管將所配制的分離膠緩沖液沿著凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，沿著凝膠腔的長玻璃板的

8、內(nèi)面緩緩注入，留出梳齒的齒高加留出梳齒的齒高加1cm的空間以便灌注的空間以便灌注濃縮膠，然后加滿蒸餾水。待分離膠凝濃縮膠，然后加滿蒸餾水。待分離膠凝固后，倒出蒸餾水，用濾紙吸干。固后，倒出蒸餾水，用濾紙吸干。四、濃縮膠的配制（四、濃縮膠的配制（5%）試劑試劑 體積體積 H2O2.92（ml）凝膠貯備液凝膠貯備液0.8（ml）分離膠緩沖液分離膠緩沖液(pH6.8)1.25（ml）10% SDS 0.05（ml）TEMED 5（ul）10%過硫酸銨過硫酸銨 25（ul）總體積總體積5.05（ml）五、濃縮膠的灌注和聚合五、濃縮膠的灌注和聚合 用移液管將所配制的濃縮膠緩沖液用移液管將所配制的濃縮膠緩

9、沖液沿著凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，沿著凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，將梳子插入膠液頂部，放置室溫下待其將梳子插入膠液頂部，放置室溫下待其聚合。聚合。六、樣品的準(zhǔn)備六、樣品的準(zhǔn)備 在低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測樣品在低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測樣品中分別加入適量還原緩沖液，放入沸水中分別加入適量還原緩沖液，放入沸水浴中加熱浴中加熱35min，取出冷至室溫。，取出冷至室溫。七、加樣七、加樣 加入電極緩沖液，加入電極緩沖液，小 心 拔 出 梳 齒 ， 用小 心 拔 出 梳 齒 ， 用微 量 注 射 器 向 凝 膠微 量 注 射 器 向 凝 膠梳 孔 內(nèi) 加 樣 。 同 時梳 孔 內(nèi) 加 樣 。 同

10、時加入加入Marker。加樣樣品遷移方向八、電泳八、電泳 上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開直流電源，剛開始時，電壓控制在不高直流電源，剛開始時，電壓控制在不高于于100V，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓控，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓控制在不高于制在不高于140V。待指示劑染料靠遷。待指示劑染料靠遷移至下沿移至下沿11.5cm處停止電泳。處停止電泳。九、染色和脫色九、染色和脫色小心將膠取出，放入一大培養(yǎng)皿中。小心將膠取出，放入一大培養(yǎng)皿中。染色：染色：加入染色液，置于搖床上染色加入染色液，置于搖床上染色2h。脫色：脫色：染色完畢，倒出染色液，加入脫色染色完畢，倒出染色液，加入脫色液，

11、置于搖床上脫色，數(shù)小時更換一次液，置于搖床上脫色，數(shù)小時更換一次脫色液，直至背景清晰，拍照。脫色液，直至背景清晰，拍照。十、相對分子質(zhì)量的計算十、相對分子質(zhì)量的計算 量出分離膠頂端距溴酚藍(lán)間的距離量出分離膠頂端距溴酚藍(lán)間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與分離以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與分離膠頂端的距離膠頂端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率，按下式計算相對遷移率mR:相對遷移率mR= 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出其分子量。品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出

12、其分子量。 蛋白質(zhì)樣品距分離膠頂端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距分離膠頂端距離(cm)思考題思考題 在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGE中，當(dāng)分離膠加完后，需在其上加一層水，為什么中，當(dāng)分離膠加完后，需在其上加一層水，為什么? 電極緩沖液中甘氨酸的作用電極緩沖液中甘氨酸的作用? 在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGE中，分離膠與濃縮膠中均含有中，分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和和AP，試述其，試述其作用作用? 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘? 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時，之間時，電泳遷移率與分子量的自

13、然對數(shù)值呈反比，符合下列方電泳遷移率與分子量的自然對數(shù)值呈反比，符合下列方程：程： lnMr =bmR+K 式中：式中：Mr為蛋白質(zhì)分子量，為蛋白質(zhì)分子量，mR為相對遷移率，為相對遷移率，b為斜為斜率，率，K為截距。在條件一定時，為截距。在條件一定時，b 和和K均為常數(shù)。均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。線上求得分子量。 【實驗試劑】電極緩沖液電極緩沖液10%過硫酸銨過硫酸銨染色液染色液脫色液脫色液一、裝板一、裝板 將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個槽中，形成一個“夾心夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，灌注膠液。灌注膠液。【操作方法】六、樣品的準(zhǔn)備六、樣品的準(zhǔn)備 在低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋