1、飼料原料中赭曲霉毒素的快速篩查 膠體金快速定量法江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義（一）介紹赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等）、花生、蔬菜（豆類）等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。動(dòng)物攝入霉變飼料后，這種毒素也可能出現(xiàn)在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要損害動(dòng)物肝臟與腎臟，引起肝臟和腎臟損傷，大量毒素也可能引起動(dòng)物腸黏膜炎癥和壞死。有報(bào)道指出，食物中的OTA與一種致命的地方性腎臟疾病（balkanendemicnephropathy）有關(guān)，且有致癌、致畸作用，近年來引起了人類營養(yǎng)學(xué)家的重視。正常條件下，小麥和玉米受OTA污染的機(jī)率較小，約1%5%，其含量

2、為0.015mg/kg；大麥和燕麥被污染的機(jī)率較高，約為10%，其含量一般在0.1mg/kg以下，個(gè)別樣品高達(dá)27mg/kg。赭曲霉毒素包括3種類型，毒性強(qiáng)弱順序是：OTA>OTC>OTB。OTB是OTA的脫氯衍生物，OTC是OTA的乙基酯，OTB和OTC的含量一般較低，毒性較OTA小。因此，飼料檢測(cè)時(shí)可以主要分析OTA含量。目前，小麥、大麥、玉米等谷類作物中OTA的測(cè)定方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）。TLC法繁瑣費(fèi)時(shí)，且靈敏度、特異性較差，提取過程中所需有機(jī)溶劑品種多

3、且量大，易污染環(huán)境，對(duì)人體有較大危害。ELISA法測(cè)定結(jié)果受試劑盒差異、實(shí)驗(yàn)溫度、儀器靈敏度等條件影響較大。GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS法普遍存在著樣品前處理過程復(fù)雜，靈敏度易受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響，耗時(shí)，檢測(cè)設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長的分析周期。同時(shí)，這些檢測(cè)方法無一例外要求在檢測(cè)過程中使用毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，給環(huán)境和檢測(cè)人員的安全造成風(fēng)險(xiǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目是通過化學(xué)合成法制備赭曲霉毒素A人工抗原，利用此抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備赭曲霉毒素A單克隆抗體，基于此原料基礎(chǔ)上開發(fā)赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條，再通過膠體金讀數(shù)儀進(jìn)行大米、玉米、小麥等樣品中赭曲霉毒素的定量分析。定量分析

4、便于將檢測(cè)結(jié)果與國家限量對(duì)比，有助于監(jiān)管部門根據(jù)糧食的污染水平進(jìn)行糧食分級(jí)管理，同時(shí)有助于企業(yè)內(nèi)部更好地進(jìn)行質(zhì)量控制。本標(biāo)準(zhǔn)可提高糧食樣品檢測(cè)、監(jiān)測(cè)效率，降低成本，保護(hù)環(huán)境，保障從業(yè)人員健康安全。（二）背景據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006年以來，玉米等飼料原料價(jià)格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時(shí)存在，在食用油等產(chǎn)品及牛

5、奶中真菌毒素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。真菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識(shí)導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商的經(jīng)濟(jì)利益。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項(xiàng)目的限量標(biāo)準(zhǔn)，越來越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保障消費(fèi)者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時(shí)在合理有利的前提下，更多地樹立我國的技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測(cè)并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂

6、貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多檢測(cè)單位高效、廣泛地開展檢測(cè)工作。建立符合中國國情的快速檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測(cè)快速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為打開市場(chǎng)并占領(lǐng)市場(chǎng)提供了先決條件。（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀1、限量標(biāo)準(zhǔn)世界各國均對(duì)食品中赭曲霉毒素A的含量做出了嚴(yán)格的規(guī)定。歐盟關(guān)于赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)分類最為詳細(xì)，未加5工谷物為g/kg，由未加工的谷物制備的所有產(chǎn)品，包括加工的谷物制品及直接供人食用的食物為3.0g/kg，供嬰幼兒食用的谷類加工食品和嬰兒食品為0.5g/kg。我國對(duì)食品中赭曲霉毒素A 的限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2761-2011）是：谷物及其制品5g/kg；豆類及其制品5g

7、/kg。我國對(duì)飼料中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)（GB13078.2-2006）是：配合飼料和玉米100g/kg。表1 我國飼料中的赭曲霉毒素A限量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品名稱限量/(g/kg)谷物及其加工產(chǎn)品100配合飼料1002、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀真菌毒素的檢測(cè)方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測(cè)方法，包括高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太復(fù)雜，國際上近些年使用這種方法檢測(cè)真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測(cè)法，主要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。GC可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素且檢測(cè)限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不

8、理想、測(cè)定時(shí)需要進(jìn)行衍生化、上一次進(jìn)樣待測(cè)物品滯留、重復(fù)進(jìn)樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系列問題。HPLC法雖可精確進(jìn)行定性定量測(cè)定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本高，同時(shí)需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的定量分析。ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡單且可實(shí)現(xiàn)定量化，但這種生物學(xué)方法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場(chǎng)上的同一物質(zhì)試劑盒檢測(cè)結(jié)果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙條易于保存且可單份測(cè)定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而且因其檢測(cè)更快

9、速、操作更簡單，測(cè)試人員無需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測(cè)行業(yè)的快速檢驗(yàn)和基層檢測(cè)，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)十分方便。（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要赭曲霉毒素A是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真菌分布于各級(jí)食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物種植、收獲、儲(chǔ)藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對(duì)食品安全的關(guān)注進(jìn)一步提高，迫切需要相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點(diǎn)，赭曲霉毒素A快速檢測(cè)技術(shù)的研

10、究及制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。2、實(shí)現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要赭曲霉毒素A是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，包括赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D四種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中分布最廣、產(chǎn)毒量最高、毒性最大、對(duì)農(nóng)作物的污染最重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素A，普遍存在于飼料、谷物及動(dòng)物體內(nèi)，可以導(dǎo)致動(dòng)物的免疫抑制、腎萎縮、胎兒畸形、流產(chǎn)及死亡，并具有高度的致癌、致畸、致突變的作用，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其定為2B類致癌物。3、適應(yīng)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)和加入WTO新形勢(shì)的需要我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個(gè)市場(chǎng)，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動(dòng)密集型

11、）進(jìn)入國際市場(chǎng)提供了很好的機(jī)遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易于被真菌污染，可能存在赭曲霉毒素A等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制約因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，給我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競(jìng)爭力，研究赭曲霉毒素A快速檢測(cè)技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查 膠體金免疫層析法標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所、中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司負(fù)責(zé)起

12、草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查 膠體金免疫層析法的起草編制過程中，主要工作包括以下幾個(gè)方面：（1）詳細(xì)查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，并對(duì)這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實(shí)用性等幾個(gè)方面考慮，選取了幾個(gè)代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。（2）及時(shí)購置相關(guān)的實(shí)驗(yàn)儀器、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料，建立了膠體金免疫層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對(duì)方法進(jìn)行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測(cè)方法。（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測(cè)方法的試驗(yàn)，包括小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕

13、、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進(jìn)行試驗(yàn)和驗(yàn)證，確保本檢測(cè)方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出飼料原料中OTA的含量。如：方法的靈敏度，選取多份陰性樣品平行測(cè)定，以均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法確認(rèn)檢測(cè)限符合要求；方法的準(zhǔn)確率，通過對(duì)經(jīng)驗(yàn)證的陽性樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到本檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，確保本方法的檢測(cè)結(jié)果可靠；原料中OTA殘留。方法的批間穩(wěn)定性，選取多份確證濃度的陽性樣品進(jìn)行不同批次的平行測(cè)定，計(jì)算批間變異系數(shù)，確保OTA毒素測(cè)定的批間穩(wěn)定性。（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗(yàn)工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和編制說明內(nèi)容。三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/

14、T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫、GB/T 20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)的要求而進(jìn)行編寫的。有關(guān)技術(shù)內(nèi)容是在參考國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定的。四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證（一）技術(shù)原理本方法應(yīng)用了競(jìng)爭疫層析原理。使用一個(gè)能夠特異性識(shí)別某一分子或某分子家族的抗體和配對(duì)的抗原，將抗體標(biāo)記膠體金顆粒，將配對(duì)的抗體噴涂到反應(yīng)膜上做檢測(cè)線。檢測(cè)過程中，如果樣品中含有待檢測(cè)物質(zhì)，則待檢測(cè)物質(zhì)首先與膠體金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，之后沿反應(yīng)膜向吸水紙方向流動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，因?yàn)榇龣z測(cè)分子表面的表面決定簇大部分已經(jīng)被

15、抗體占據(jù)，少量與檢測(cè)線處的抗原結(jié)合，形成比較淺的色帶，待檢測(cè)物質(zhì)-膠體金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物繼續(xù)沿反應(yīng)膜流動(dòng)，到達(dá)質(zhì)控線后被質(zhì)控線處的膠體金顆粒抗體所捕獲，形成清晰可見的色帶。反應(yīng)完成后，使用讀數(shù)儀讀取檢測(cè)區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域的顏色強(qiáng)度信號(hào)，根據(jù)內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中OTA毒素的含量。（二）適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了膠體金法測(cè)定飼料原料樣品中赭曲霉毒素A的條件和詳細(xì)分析步驟。本方法適用于小麥、大米和玉米等谷物中赭曲霉毒素A毒素快速定量篩查的測(cè)定，檢測(cè)限為<2g/kg。（三）關(guān)于樣品制備的要求理論上講樣品顆粒的大小與樣品的均勻性以及毒素的提取效率有關(guān)，當(dāng)樣品細(xì)度不足20目時(shí)，真菌毒素的提取效

16、率較低，因此國家標(biāo)準(zhǔn)方法中真菌毒素檢測(cè)的制樣一般都要求制備至少500g，全部通過20目篩，本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)直接采用，從測(cè)試數(shù)據(jù)看，能夠滿足方法需求。（四）方法精密度及準(zhǔn)確度采用5µg/kg、10µg/kg和20 µg/kg三個(gè)濃度水平的陽性樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定10次，重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)在4%-13%之間，平均變異系數(shù)為8.34%，結(jié)果見表2。表2飼料樣品中赭曲霉毒素A檢測(cè)數(shù)據(jù)分析表（濃度：µg/kg）編號(hào)測(cè)定結(jié)果參考濃度（µg/kg）5102015112226102335102146112054122266102075112286102195122

17、21051123平均結(jié)果（µg/kg） 5.3010.80 21.60標(biāo)準(zhǔn)偏差0.670.791.07變異系數(shù)（%）12.737.304.98（五）檢測(cè)限取20份陰性樣品平行測(cè)定，結(jié)果均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為1.71，本方法的檢出限為2µg/kg，陰性樣品結(jié)果見表3。表3 陰性飼料樣品赭曲霉毒素A測(cè)定結(jié)果分析表（濃度：µg/kg）樣品編號(hào)測(cè)定結(jié)果112030415060718090100110121130140151160171180190200平均結(jié)果（µg/kg）0.3標(biāo)準(zhǔn)偏差0.47檢測(cè)限（µg/kg）1.71（六）批間穩(wěn)定性采用5 µ

18、;g/kg左右濃度水平的陽性樣品，不得低于6個(gè)批次，每個(gè)批次測(cè)定不低于2次，批內(nèi)測(cè)定取平均值，通過批間變異系數(shù)來表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)25%。經(jīng)多批次平行測(cè)定，次方法符合變異系數(shù)要求，批間穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表4。表4飼料樣品赭曲霉毒素A批間穩(wěn)定性測(cè)定數(shù)據(jù)分析表（濃度：µg/kg）批次號(hào)測(cè)定結(jié)果（µg/kg）批次內(nèi)平均值（µg/kg）參考濃度（µg/kg）批次間平均值（µg/kg）標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)（%）144.555.170.7614.575254.54355.564666554.546666（七）HPLC和膠體金定量檢測(cè)條結(jié)果比對(duì)隨機(jī)抽取小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品，用本方法和儀器方法分別進(jìn)行檢測(cè)。儀器方法參考GB/T 30955-2014飼料中赭曲霉毒素A、B2、G1、G2的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜，對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)限為0.2g/kg，定量限為1.0g/kg。本方法的檢測(cè)限為10g/kg。結(jié)果見表5。表5 儀器比對(duì)測(cè)定結(jié)果樣品編號(hào)樣品類型HPLC檢測(cè)結(jié)果（µg/kg）膠體金定量檢測(cè)條結(jié)果（µg/kg）1小麥5.87720.05031.2424玉米3.