1、人Era蛋白在大腸桿菌中的高效表達及其純化 作者：吳元明，陳蘇民，陳南春，紀宗玲，劉惠萍，張俊杰【關鍵詞】 人Era基因關鍵詞: 人Era基因;基因表達;蛋白純化 摘 要:目的 在大腸桿菌中對人的era基因（簡稱hera）進行表達、純化. 方法 PCR擴增hera基因，測序正確后克隆入大腸桿菌融合表達載體pRSET-C，重組質粒pRSETC-hera以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，用IPTG進行誘導表達.然后利用親和層析的方法對表達蛋白進行純化. 結果 克隆了hera基因，測序正確;利用pRSET-C載體在大腸桿菌中融合表達了全長hera-cDNA基因，表達量占細菌總蛋白的59.6%.融

2、合蛋白在菌體內主要以包涵體形式存在，在變性條件下用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白，其純度達到了98.0%. 結論 利用基因重組技術在大腸桿菌中高表達了hera基因.并對融合蛋白進行了初步純化. Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation 1 / 14Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified

3、by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）andinduced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be co

4、rrect.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CON

5、CLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily. 0 引言 era基因是1986年在測定大腸桿菌基因組序列時，在編碼RNaseIII的rnc基因下游發現的一個開放讀框，因其編碼的氨基酸序列與人及酵母的Ras蛋白有部分相似之處，命名為E.coli Ras-like（era）基因1 .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕蟲、小鼠、人

6、、植物中也存在與細菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成員.它由兩個結構域組成:N端是一個典型的GTPase結構域;C端結構域為Era所特有，其中含有一個KH結構域2 .在大腸桿菌中era基因和rnc基因同屬于rnc操縱元，rnc基因和era基因的表達共同受RNaseIII的負調控3 .era是大腸桿菌中可以正常表達的基因，但表達水平極低.遺傳學實驗證實era基因與細胞周期和細胞分裂有關，是細菌生存繁殖所必需的重要基因 4 .高表達的細菌Era蛋白有GTP結合及GTPase活性5 .最近發現細菌Era蛋白可以特異地與16S-rRNA結合6 . 本室陳蘇民教授通過計算機尋索，發現

7、從線蟲、小鼠到人都有與細菌era同源的EST序列，并且相繼克隆了人及小鼠全長的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全長約2.2kb，含長度為1038bp的開放讀框，編碼346氨基酸的蛋白質7 .人Era（hEra）與大腸桿菌Era（eEra）蛋白全序列比較，有31.0%相同、53.0%相似.同樣，hEra也是由N端的GTPase結構域和C端KH結構域所構成8 .新近克隆的人及小鼠era基因為整個era基因家族的功能研究提供了重要的資料.本研究目的是將hera基因在大腸桿菌中進行高表達、純化.這為進一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基礎. 1 材料和方法 1.1 材料 大腸桿菌BL2

8、1（DE3）菌種購自Promega公司.pUC19質粒均為本教研室保存;表達質粒pRSET-C為Invitrogen公司產品.pBS-hera為陳蘇民教授提供.各種限制性內切酶、連接酶、核酸修飾酶及Taq酶均為Gibco公司產品.DNA marker和蛋白marker為Takara公司產品.柱式質粒純化試劑盒為華舜公司產品.NucleoTrap Gel Extraction試劑盒購于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit為QIAGEN公司產品. 1.2 方法 1.2.1 PCR反應及產物的鑒定 PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向

9、:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反應以pBS-hera為模板在PE公司9600反應儀上進行.PCR反應條件為:9630s，5545s，7260s，30個循環.純化的PCR產物用BamHI和PstI雙酶切定向克隆入pUC19質粒，轉化E.coli JM109，進行藍白篩選，并經酶切鑒定篩選出含插入片段的陽性克隆.重組的pUC19質粒經提取純化后，以此作為測序模板，在PE公司310型測序儀上進行核苷酸序列分析. 1.2.2 重組表達載體構建 從重組的pUC19質粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI雙酶切pRSET-C載體.

10、目的片段與載體片段均用NucleoTrap Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠內回收.然后進行DNA的連接，將DNA連接液轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，用氨芐抗性進行篩選，經酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆. 1.2.3 蛋白誘導表達 挑取pRSETC-hera重組表達菌株，接種于5mL含Amp的2xYT培養基（胰蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37培養過夜，次日按4.0%轉接于含Amp的2xYT培養基，37振蕩培養3h，加入IPTG至終濃度1mmol L-1 誘導表達，37振蕩培養27h.取菌體，做120g L-1 SDS-

11、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）. 1.2.4 SDS-PAGE 49000g離心5min收集菌體，用含3mL L -1 巰基乙醇加樣緩沖液處理（100， 10min），12000g離心10min，采用Laemmli不連續PAGE，150g L-1 分離膠，考馬斯亮藍R-250染色. 1.2.5 蛋白質的純化 離心收集100mL誘導菌液的菌體，按每克濕菌體10mL加入超聲緩沖液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）懸浮，-20凍融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室溫放置30min，然后超聲裂解（150W，每次1min，共5次），4下12000g

12、離心20min.再加入超聲緩沖液10mL懸浮包涵體，4下12000g離心20min，收集包涵體沉淀.用5mL緩沖液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）懸浮包涵體，Vortex，室溫放置2h，4下12000g離心15min，取上清，4下12000g再離心15min，留上清上Ni-NTA親和色譜柱.先用緩沖液B預平衡Ni-NTA柱，上樣，用緩沖液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3）洗滌，接著用緩沖液D（8mol L-1 尿素，

13、100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH5.9）洗滌，再用緩沖液D1（緩沖液C，250mmol L-1 咪唑）洗脫，用緩沖液E（8mol L-1 尿素，100mmol L1 NaH 2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH4.5）灌洗.在280nm監測下，收集每個吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE. 2 結果 2.1 hera基因的擴增 以pBS-hera質粒為模板，經PCR擴增獲得hera基因片段，擴增產物經1.0%AGE，與編碼hEra全長的cDNA（1038bp）大小相符（Fig1）.將全長hera基因片段克隆入

14、pUC19質粒，重組質粒轉化DH5感受態細胞，從培養板上隨機挑選白色克隆，從中提取質粒，用BamHI和PstI雙酶切鑒定，含有插入片段的重組質粒命名為pUC19-hera.酶切鑒定結果見Fig2.提取重組質粒pUC19-hera，以pUC19通用測序引物進行核苷酸序列測定.測序結果表明，所擴增的hera基因與已知序列完全相符.2.2 pRSETChera表達質粒的構建和誘導表達 將hera-cDNA基因全長從pUC19-hera亞克隆到表達載體pRSET-C中，經酶切鑒定，將重組表達質粒命名為pRSETC-hera.酶切鑒定結果見Fig3.將pRSETC-hera質粒轉化BL21（DE3）感受

15、態細胞，在2xYT培養基中生長，轉接后用IPTG誘導4h，由120g L-1 SDS-PAGE結果可見:與未誘導的對照菌相比誘導菌在Mr 42×103 處有明顯的新蛋白表達帶出現，大小和預期的6His-hEra融合蛋白相符（Fig4），激光薄層掃描結果表明此表達條帶占菌體總蛋白的59.6%.表達產物主要以包涵體的形式存在.2.3 6HishEra融合蛋白的純化 收集100mL誘導菌液的菌體，經裂菌、離心、洗滌、再離心后獲得包 涵體沉淀.包涵體被變性溶解后上Ni-NTA柱，用緩沖液C，D洗滌，用含咪唑的緩沖液D1洗脫，再用緩沖液E灌洗.在280nm監測下，觀察蛋白的流出情況.收集每個吸

16、收峰并行120g L-1 SDS-PAGE（Fig5）.激光薄層掃描結果表明，用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白的純度達到了98.0%. 3 討論 我們利用基因工程的手段在pRSET-C載體內高表達了hEra蛋白.pRSET-C是一個受PT7 強啟動子驅動下的融合表達載體，因而易于在原核進行的目的基因高表達.另外，在目的基因的5'端融合了6個組氨酸的純化標簽，可以用金屬螯合親和層析來分離純化表達的融合蛋白.組氨酸與金屬離子的結合與蛋白質的空間結構無關，因此表達的融合蛋白就可以在變性條件下得到純化，然后復性，這就避免了復性后的蛋白質由于純化條件的改變而丟失. 不同的培養條件對外源基因

17、的表達效率也有一定的影響.含pRSETC-hera質粒的BL21（DE3）菌在LB培養基中IPTG誘導6His-hEra融合蛋白表達時，表達產物占菌體總蛋白的30.0%;當改用2xYT培養基時，外源基因的表達效率明顯提高，表達產物達菌體總蛋白的59.6%.在不同培養基培養條件下，表達產物均以包涵體形式存在.我們先對包涵體進行了分離、洗滌和純化.然后用金屬親和層析的方法對其進行了進一步的純化、復性.當pH6.3時，融合了6個組氨酸的蛋白質能和螯合了Ni2+ 的金屬親和層析柱相結合;而當pH=5.9或在咪唑存在的情況下，融合蛋白不再與Ni2+ 結合而被洗脫下來.我們在實驗中發現，用含咪唑的洗脫液進

18、行洗脫的方法要好于通過降低pH值進行洗脫的方法.首先降低pH值不能將融合蛋白洗脫干凈，我們用pH=5.9的洗脫液進行洗脫時（Fig5），就不能將融合蛋白洗脫下來.另外，結合緩沖液的pH值與洗脫緩沖液的pH值相差僅0.4，溶液的pH值又易受環境的影響，因此在每次實驗前需精心調試，給實際操作帶來諸多不便. 隨著基因組計劃的進展，許多生物的基因組序列測定工作已經或即將完成.但是序列測定后，基因的功能及其表達調控的研究將成為后基因組時代最重要的任務.era基因是一個從細菌到人高度保守的小G蛋白基因.以前era基因的功能研究都局限于原核生物，難以揭示整個era基因的功能.本研究為era基因在真核生物的功

19、能研究打下了基礎. 參考文獻: 1Ahnn J，March PE，Takiff HE，Inouye M.A GTP-binding pro-tein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins J.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83（3）:8849-8853. 2Chen X，Court DL，Ji X.Crystal structure of ERA:A GTPase-dependent cell cycle regulator containing an RNA binding motif J.Pr

20、oc Natl Acad Sci USA，1999;96（2）:8396-8401. 3Chen SM，Court DL.Coexpression of era with rnc gene in Es-cherichia coli J.Shengwu Huaxue Zazhi（Chin Biochem J），1991;7（5）:518-524. 4Britton RA，Powell BS，Dasgupta S，Sun Q，Margolin W，Lup-ski JR，Court DL.Cell cycle arrest in Era GTPase mutants:A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Es-cherichia coli J.Mol Microbiol，1998;27（13）:739-775. 5Chen SM，Court DL.Purification and some biochemical proper-ties of soluble Era