1、慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾抑制TLR基因的表達(dá)【摘要】 目的：研究慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾對有TLR2 或者TLR4表達(dá)的小鼠來源的細(xì)胞株抑制干擾效率。方法：根據(jù)GeneBank小鼠的TLR2 或者TLR4基因mRNA的已知序列，在 【關(guān)鍵詞】 小鼠;慢病毒感染;RNA干擾;TLR2;TLR4【ABSTRACT】Objective:To investigate the transfection efficiency of RNA mediated by lentivirus and intereference effects on TLR2 or TLR4 gene in mouse cel

2、ls.Methods:According to the known arry of TLR2 or TLR4 gene in GeneBank Mouse,the targeting arry to fit in with the features was found,to code synthesis of GeneBank in vitro,collect the virus,infect the targeting cells,and check efficiency of interference.Resuls:The efficiency of interference was so

3、 obvious that it reached to above 80 percent.Conclusion:Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silent gene expression and could be used in the study of function for TLR gene in mouse so as to measure some proten and to reveal its effets.2 / 20【KEY WORDS】Mice,Lentivirus infecti

4、ons,RNA interference,TLR2,TLR4一直以來，人們對于固有免疫及其炎癥反應(yīng)的信號通路尚未完全闡明，近年來，隨著果蠅Toll蛋白的發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動物和人類也存在著一類與果蠅Toll蛋白相似的跨膜蛋白，即Toll樣受體(toll-like receptor,TLRs),在免疫及炎癥反應(yīng)的信號傳導(dǎo)中扮演重要的角色1。吞噬作用是宿主固有免疫抵御外來入侵病原微生物的另一個關(guān)鍵因素2。由巨噬細(xì)胞引起的吞噬作用和隨后的病原體降解在宿主應(yīng)對微生物感染的固有免疫中發(fā)揮了樞紐的作用。最近的研究表明，TLRs在通過上調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬活力和促進(jìn)細(xì)菌的清除中發(fā)揮重要的作用3。RNAi(RN

5、A interference)技術(shù)的出現(xiàn),為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強(qiáng)有力的研究工具4。我們在已經(jīng)獲取TLR基因的RNAi有效靶序列的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定表達(dá)TLRsiRNA的慢病毒載體,為研究TLR基因在巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制和基因治療打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑三羥甲基氨基甲烷(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司),胎牛血清(杭州四季青公司),小鼠OPN一抗、小鼠STAT3一抗、小鼠B-actin一抗(美國Santa Cruz公司)。病毒包裝質(zhì)粒由上海吉瑪生物公司合成。1.2慢病毒RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.1針對TLR2或者TLR4干擾序列的設(shè)計(jì)及編碼siRNA D

6、NA模板的體外合成1.2.2siRNA靶位點(diǎn)的選擇根據(jù)GeneBank小鼠的TLR2 或者TLR4基因mRNA的已知序列，在尋找符合特征的靶序列。靶序列尋找的基本指導(dǎo)原則：ATG下游25nt開始，尋找AA(N19).序列，如果沒有合適的序列，尋找NAR(N17)YNN,R is a purine(A,G),and Y is a pyrimidine(C,U).;G-C 含量在 36%52%;正義鏈的3端要有相對低的穩(wěn)定性，在其15-19的位置至少要有一個A or T;避免4個或多個同一核苷酸重復(fù)，特別是T的重復(fù)，因?yàn)閜olyT是一種RNA聚合酶終止信號;一個基因需要設(shè)計(jì)34個靶序列的siRNA

7、。1.2.3編碼siRNA DNA模板的體外合成選擇3-4個靶位點(diǎn),用blast軟件進(jìn)行序列同源性分析,并用RNA structure 4.2軟件對其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,每條模板鏈的組成包括21個堿基正義鏈和與其互補(bǔ)的21個堿基的反義鏈,正反鏈之間有6個堿基(CTCGAG)間隔,反義鏈之后有5個T作為轉(zhuǎn)錄終止信號。由上海吉瑪生物公司合成,將合成的寡核苷酸用ddH2O 配成20 mol/L，按照以下體系進(jìn)行混合：5 LForward oligo5 LReverse oligo5 L10×退火緩沖液35 LddH2O水浴鍋里煮沸10min后，然后自然冷卻至室溫，獲取雙鏈。1.2.4pLKO.1

8、 scramble shRNA載體線性化及回收將pLKO.1 scramble shRNA用AgeI和EcoR I雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，測定線性化載體濃度。1.2.5載體與siRNA模板鏈連接連接體系中模板與載體的摩爾數(shù)比約為351，充分混勻，加入T4連接16反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物可立即轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或于-20保存。1.2.6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取100L的感受態(tài)細(xì)菌，加入pLKO.1 scramble shRNA與siRNA連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻,冰浴30min，42熱休克90s，快速放置冰浴中2min，加入800L LB培養(yǎng)基(不含Amp)，37振蕩培養(yǎng)60min，吸100L培

9、養(yǎng)液滴于含Amp的LB平板涂勻，待表面液體吸收后，倒置平皿37培養(yǎng)1620h。1.2.7陽性重組克隆的篩選挑取單個菌落，接種于3mL含Amp(100g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜，次日取1.5mL于Eppendorf管中，10 000rpm離心1min，收集菌體，加入冰冷的溶液100L(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)，冰浴5min，加入新鮮配制的溶液200L(10%SDS，0.2N NaOH)，輕輕混勻，加入溶液150L(60mL 5mol/L KAc，11.5mL HAc，28.5mL H2O)，顛倒混勻，冰浴

10、5min，40C，10 000rpm離心10min，取上清，加入2倍體積無水乙醇，充分混勻，室溫放置5min，15 000rpm離心10min，棄上清，加入冰冷的75%乙醇洗一次，離心室溫干燥，用含RNase(50g/mL)的雙蒸水10L充分溶解沉淀。用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和 NcoI雙酶切重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性克隆送出測序，引物如下:5 CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A 31.3干擾效率的檢測選取有TLR2或者TLR4表達(dá)的小鼠來源的細(xì)胞株，將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)，37,5%CO2孵箱中孵育72h后，收集細(xì)胞分別用蛋白裂解液及Trizol

11、裂解細(xì)胞提取總蛋白及總RNA,待做Western blot及RT-PCT分析。在干擾效率大于70%時，進(jìn)行慢病毒包裝。1.4慢病毒包裝1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA溶液的制備提取慢病毒包裝系統(tǒng)中三種質(zhì)粒DNA，干擾效率達(dá)到70%以上的穿梭質(zhì)粒，psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.82.0之間。轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，重新接種于 6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細(xì)胞密度達(dá)70%80%時即可用于

12、轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，因此需要保證良好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液1gpLKO.1 shRNA plasmid750ngpsPAX2 packaging plasmid250ngpMD2.G envelope plasmidto 20Lserum-free OPTIMEM在室溫下溫育5min。將Lipofeetamine2000試劑輕柔搖勻，取Lipofectamine2000試劑在另一管中與OptiMEM混合，在室溫下溫育5min。把稀釋后的

13、DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5min之內(nèi)混合。混合后，在室溫下溫育20min，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將DNA與Lipofeetamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20mL的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。0每皿細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。

14、1.4.2病毒的收獲收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清液。于4，1 250rpm，離心5min除去細(xì)胞碎片。以0.45pm濾器過濾上清液于50mL corning管中。-20 或-80保存。1.5侵染靶細(xì)胞，檢測有關(guān)蛋白基因的表達(dá)，揭示TLR在當(dāng)中的作用細(xì)胞鋪板，根據(jù)不同需要決定接種細(xì)胞數(shù)目。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，以檢測的MOI值轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，再往培養(yǎng)基內(nèi)加入Polybrene，調(diào)至終濃度為8g/mL，輕輕混勻，37過夜。第二天，換新鮮培養(yǎng)基。第三天，換新鮮培養(yǎng)基(含有嘌呤霉素)培養(yǎng)。AssayDays post-infectionmRNA knockdown(quantitative PCR) 3 day

15、sProtein knockdown(western blot) 4 daysPhenotypic assay 4 days隨后，檢測有關(guān)蛋白基因的表達(dá)，揭示TLR在當(dāng)中的作用。2結(jié)果2.1測序結(jié)果如下。第1條 (S1)forward oligo:5-CCGGAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGGAGGTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGG測序結(jié)果：第2條 (S2)forward oligo:5-CCGGAAGTCCAGCAG

16、AATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAAGTCCAGCAGAATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTT-3測序結(jié)果：第3條：(S3)forward oligo:5-CCGGAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTT-3測序結(jié)果：2.2干擾效率

17、檢測檢測表明干擾效果明顯，達(dá)到80%以上。1：細(xì)胞2：P LKO.1-shRNA3：S14：S25：S3圖1干擾效果WB檢測圖A：GFPB：white lightC：病毒噬斑照片圖2慢病毒轉(zhuǎn)染效果圖2.3重組慢病毒PLKO.1-TLR2-S3-shRNA的包裝將干擾效果最好的PLKO.1-TLR2-S3-shRNA，進(jìn)行慢病毒包裝。3討論RNA干擾是進(jìn)化中保守的一種過程，在基因的轉(zhuǎn)錄后針對含有特異性序列的mRNA進(jìn)行沉默5。RNAi技術(shù)的出現(xiàn),成了一種新的反向遺傳學(xué)手段被廣泛地應(yīng)用于基因功能分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究和基因治療。質(zhì)粒介導(dǎo)RNAi有一定的局限性,轉(zhuǎn)染率低,基因抑制表達(dá)作用弱,持續(xù)時間

18、短,不適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)6。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,以HIV21為基礎(chǔ)發(fā)展而得,具有許多優(yōu)點(diǎn),能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞,而且病毒的遺傳物質(zhì)能夠整合到宿主的基因組,將其用于瘤的基因治療,除比其他病毒載體更具優(yōu)勢外,病毒的VSVG外殼使載體病毒顆粒具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性,慢病毒載體RNAi作用持久,同時擴(kuò)大了載體感染細(xì)胞的范圍,因此慢病毒載體是很有前途的基因治療載體。最近,用慢病毒載體介導(dǎo)RNAi的幾項(xiàng)體內(nèi)外研究7即顯示了該技術(shù)策略在內(nèi)源性基因功能研究和基因治療前沿領(lǐng)域的重大意義。人類TLRs家族至少有11個成員，各自識別特異的病原體相關(guān)模式分子，擁有特殊的細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與了機(jī)體

19、應(yīng)對不同病原微生物入侵的免疫反應(yīng)。TLR2和TLR4兩者都在細(xì)胞膜上表達(dá)，分別涉及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分的識別。TLR2能夠識別革蘭氏陽性細(xì)菌壁成份脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)，肽聚糖和脂肽，而應(yīng)對革蘭氏陰性細(xì)菌壁成份內(nèi)毒素/LPS則需要TLR48。TLR2和TLR4在識別病原微生物、產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和啟動宿主炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。在應(yīng)對外來病原微生物分子的過程中，TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。各個TLRs在微生物之間分辨能力似乎是宿主對各種病原體防御特異性的決定因素，這種特異性可借助TLRs的相互作用來達(dá)到。由于TLRs是

20、識別外來入侵病原微生物和活化宿主天然免疫系統(tǒng)的主要成份，TLRs表達(dá)和信號傳遞的變化不僅在膿毒血癥而且在外科應(yīng)激的發(fā)病機(jī)理中也發(fā)揮著重要的作用。巨噬細(xì)胞通過多種吞噬受體如Fc受體(FcRs)、補(bǔ)體受體3(CR3)檢測到入侵病原體9。在微生物病原體的吞噬過程中，表面的TLRs包括TLR4和TLR2被募集到吞噬體并被微生物細(xì)胞壁成分活化。即使TLR4和TLR2的刺激是否調(diào)節(jié)吞噬體的成熟仍然是一個尚有爭論的問題，TLRs的結(jié)合被證明可通過IRAK-4和P38激活MyD88依賴的信號，導(dǎo)致許多吞噬基因表達(dá)程序的上調(diào)。我們的前期工作(江蘇省衛(wèi)生廳重大項(xiàng)目K200509)主要探討了Toll樣受體在新生兒手

21、術(shù)應(yīng)激中的意義，我們發(fā)現(xiàn)新生兒和嬰幼兒手術(shù)應(yīng)激后，術(shù)后即刻外周血單核細(xì)胞表面TLR2和TLR-4表達(dá)水平有明顯下降的趨勢，術(shù)后1d恢復(fù)正常水平;經(jīng)過進(jìn)一步分析，有感染的新生兒和嬰幼兒，術(shù)后1d TLR-2和TLR-4水平仍較低。據(jù)此，我們推測提出如下假設(shè)：手術(shù)應(yīng)激可導(dǎo)致TLR-2和TLR-4受體表達(dá)水平的下降，從而影響吞噬體的成熟，導(dǎo)致感染并發(fā)癥的增加。而這一點(diǎn)在新生兒和嬰幼兒由于其巨噬細(xì)胞吞噬體成熟的滯后和缺陷而表現(xiàn)尤為突出。基于上述的認(rèn)識，本課題將在延續(xù)我們多年研究的基礎(chǔ)上，對嬰幼鼠及成年鼠吞噬體成熟和殺菌功能及其作用機(jī)理進(jìn)行研究，著重闡明兩個問題：明確嬰幼和成年小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬體成熟是否存在不同;Toll樣受體在巨噬細(xì)胞吞噬體成熟過程中發(fā)揮的作用。如能達(dá)到預(yù)期目的，將為開展新生兒重癥感染時的免疫調(diào)控干預(yù)提供進(jìn)一步的理論依據(jù)，此舉具有重大的科學(xué)價值。【參考文獻(xiàn)】 1Takeda K,Akira S.Toll-like receptors in innate immunityJ.Int Immunol,2005,17(1):1-14.2Stuart LM,Ezekowitz RA.Phagocytosis:elegant complexityJ.Immunity,2005,22(5):539-550.3McCoy CE,ONeill LA.The role of tol