1、4.3 代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應用代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應用工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產物。工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。謝朝著人們希望的方向進行。人工控制代謝的手段：人工控制代謝的手段： 改變微生物遺傳特性改變微生物遺傳特性(遺傳學方法）；遺傳學方法）； 控制發(fā)酵條件（生物化學方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學方法）； 改變細胞膜透性；改變細胞膜透性；工業(yè)發(fā)酵的目的工業(yè)發(fā)酵的目的大量地積累人們所需要的微生物

2、代謝產物。大量地積累人們所需要的微生物代謝產物。 在正常生理條件下在正常生理條件下 微生物通過其代謝調節(jié)系統(tǒng)吸收利用營養(yǎng)物質用于合微生物通過其代謝調節(jié)系統(tǒng)吸收利用營養(yǎng)物質用于合成細胞結構，進行生長和繁殖，它們通常不浪費原料和成細胞結構，進行生長和繁殖，它們通常不浪費原料和能量，也不積累中間代謝產物能量，也不積累中間代謝產物 代謝的人工控制代謝的人工控制 人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進行著人們希望的方向進行 （1）對于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺）對于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產物陷性突變

3、株只能積累中間代謝產物 a a b b c c d d e 4.3.1.1營養(yǎng)缺陷型菌株的應用營養(yǎng)缺陷型菌株的應用 末端產物末端產物e對生長乃是必需的，所以，應在培養(yǎng)基中限量供給對生長乃是必需的，所以，應在培養(yǎng)基中限量供給e，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調節(jié)（阻遏或抑制），使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產物這樣才能有利于菌株積累中間產物c 。4.3.1.遺傳學方法遺傳學方法(2) 分支代謝途徑：情況較復雜，可利分支代謝途徑：情況較復雜，可利用營養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制用營養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產物，亦可利

4、用雙重缺陷發(fā)酵積累末端產物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產中間產物生產中間產物a b cdefg各圖成立的條件：各圖成立的條件：1. 1. 限量添加限量添加e e；2.2.限量添加限量添加e e；3.3.限量添加限量添加e e和和g g；4.4.限量添加限量添加e e和和g g；5.5.限量添加限量添加i i“”“”表示營養(yǎng)缺陷突變位置；表示營養(yǎng)缺陷突變位置；“”表示反饋調節(jié)解除表示反饋調節(jié)解除要根據(jù)其不同反饋控制機制 谷氨酸棒桿菌的代謝調節(jié)與賴氨酸生產谷氨酸棒桿菌的代謝調節(jié)與賴氨酸生產 e e：表示反饋抑制；：表示反饋抑制；r r：表示反饋阻遏：表示反饋阻遏 高絲氨酸脫氫酶（hsdh） 天冬氨酸激

5、酶（ak) 賴氨酸生產菌賴氨酸生產菌: : 高絲氨酸缺陷型 分支途徑分支途徑賴氨酸發(fā)酵賴氨酸發(fā)酵: :谷氨酸棒桿菌的谷氨酸棒桿菌的hom分支途徑分支途徑肌苷酸發(fā)酵肌苷酸發(fā)酵（impimp合成途徑的代謝調控）合成途徑的代謝調控）調控理論的實踐應用調控理論的實踐應用4.3.1.24.3.1.2抗反饋控制突變株的應用抗反饋控制突變株的應用抗反饋控制突變株抗反饋控制突變株是指對反饋抑制不敏感或是指對反饋抑制不敏感或對阻遏有抗性，或兩者兼有之的菌株。對阻遏有抗性，或兩者兼有之的菌株。抗反饋控制突變株可以從抗反饋控制突變株可以從終產物結構類似物抗性終產物結構類似物抗性突變株突變株和和營養(yǎng)缺陷性回復突變株營

6、養(yǎng)缺陷性回復突變株中獲得。中獲得。獲得方法及其原理：獲得方法及其原理：目標產物目標產物結構類似物結構類似物賴氨酸賴氨酸s-s-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-l-l半胱半胱氨酸氨酸-(aec)-(aec)蘇氨酸蘇氨酸 - -氨基氨基- - - -羥基戊酸羥基戊酸（ahv)ahv)異亮氨酸異亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸d-d-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸對氟苯丙氨酸對氟苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型回復突變株營養(yǎng)缺陷型回復突變株 調節(jié)酶的變構特性是由其結構基因決定的，如果調節(jié)調節(jié)酶的變構特性是由其結構基因決定的，如果調節(jié)酶的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能性：酶的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能性：一是

7、催化亞基和調節(jié)亞基的基因均發(fā)生突變；一是催化亞基和調節(jié)亞基的基因均發(fā)生突變；另一種可能僅僅是催化亞基發(fā)生突變。另一種可能僅僅是催化亞基發(fā)生突變。一是催化亞基和調節(jié)亞基恢復到第一次突變前的活性水平。一是催化亞基和調節(jié)亞基恢復到第一次突變前的活性水平。 如果前者發(fā)生回復突變，則又有兩種可能性如果前者發(fā)生回復突變，則又有兩種可能性另一種是催化亞基得以恢復，而調節(jié)亞基喪失了調節(jié)的功能。另一種是催化亞基得以恢復，而調節(jié)亞基喪失了調節(jié)的功能。營養(yǎng)缺陷型回復突變營養(yǎng)缺陷型回復突變 4.3.1.3選育組成型突變株和超產突選育組成型突變株和超產突變株變株如果調節(jié)基因發(fā)生突變，以至產生無效的阻遏物而如果調節(jié)基因發(fā)

8、生突變，以至產生無效的阻遏物而不能和操縱基因結合，或操縱基因突變，從而造成不能和操縱基因結合，或操縱基因突變，從而造成結構基因不受控制的轉錄，酶結構基因不受控制的轉錄，酶 的生成將不再需要的生成將不再需要誘導劑或不再被末端產物或分解代謝物阻遏，這樣誘導劑或不再被末端產物或分解代謝物阻遏，這樣的突變株稱為的突變株稱為 組成型突變株。少數(shù)情況下，組成組成型突變株。少數(shù)情況下，組成型突變株可產生大量的、比親本高的多的酶，這種型突變株可產生大量的、比親本高的多的酶，這種突變株稱為超產突變株。突變株稱為超產突變株。組成型突變株組成型突變株 結構基因不受控制地轉錄，酶結構基因不受控制地轉錄，酶的生成將不再

9、需要誘導劑或不的生成將不再需要誘導劑或不再被末端產物或分解代謝物阻再被末端產物或分解代謝物阻遏。遏。 調節(jié)基因發(fā)生突變調節(jié)基因發(fā)生突變產生無效的阻遏物而不產生無效的阻遏物而不能與操縱基因結合能與操縱基因結合操縱基因突變操縱基因突變突變操縱基因不突變操縱基因不能與阻遏物結合能與阻遏物結合組成型突變組成型突變 da b c e f4.3.2生物化學方法生物化學方法1. 1. 添加前體繞過反饋控制點：亦能使某種代謝產物大量產生添加前體繞過反饋控制點：亦能使某種代謝產物大量產生(-)(-)(-)2. 2. 添加誘導劑：從提高誘導酶合成量來說，最好的誘導劑往往添加誘導劑：從提高誘導酶合成量來說，最好的誘

10、導劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物，不是該酶的底物，而是底物的衍生物，3. 3. 發(fā)酵與分離過程耦合：發(fā)酵與分離過程耦合：4. 4. 控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：4.3.2控制細胞膜滲透性控制細胞膜滲透性 使胞內的代謝產物迅速滲漏出去使胞內的代謝產物迅速滲漏出去,解除末端產物的反饋抑制。解除末端產物的反饋抑制。 (1). 用生理學手段用生理學手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺損直接抑制膜的合成或使膜受缺損 如如: 在在glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量亞適量可大量分泌可大量分泌glu； 控制生物素的含量可改變細胞膜的成分，進而改變膜透性；控制生物素

11、的含量可改變細胞膜的成分，進而改變膜透性； 當培養(yǎng)液中生物素含量較高時采用適量添加青霉素的方法；當培養(yǎng)液中生物素含量較高時采用適量添加青霉素的方法； 再如：產氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是再如：產氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是mn2+； mn2+的的作用與生物素相似。作用與生物素相似。(2). 利用膜缺損突變株利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型 如如:用谷氨酸生產菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添用谷氨酸生產菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸加油酸，合成有缺損的膜，使細胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產量。產量

12、。 甘油缺陷型菌株的細胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造甘油缺陷型菌株的細胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或成谷氨酸大量滲漏。應用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。控制細胞膜的通透性控制細胞膜的通透性生物素是脂肪酸生物合成中乙酰生物素是脂肪酸生物合成中乙酰coacoa羧化酶的輔羧化酶的輔基，該酶催化乙酰基，該酶催化乙酰coacoa的羧化生成丙二酸單酰的羧化生成丙二酸單酰coacoa，進而合成細胞膜磷脂的主要成分脂肪酸，進而合成細胞膜磷脂的主要成分脂肪酸 只要控制生物素

13、的含量就可以改變細胞膜的成分，只要控制生物素的含量就可以改變細胞膜的成分，進而改變膜的通透性，影響到代謝產物的分泌。進而改變膜的通透性，影響到代謝產物的分泌。 甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株 添加適量的青霉素添加適量的青霉素 油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株 5、微生物次級代謝與次級代謝產物5.1、次級代謝與次級代謝產物一類與生物生存有關的、涉及到產能代謝和耗能代謝的代謝類型，普遍存在于一切生物中。初級代謝：微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動所必需所必需的物質和能量的過程，稱為初級代謝。某些生物為了避免在初級代謝過程某種中間產物積累所造成的不利作用而產生的一類有利

14、于生存的代謝類型。可以認為是某些生物在一定條件下通過突變獲得的一種適應生存的方式。通過次級代謝合成的產物通常稱為次級代謝產物，大多是分子結構比較復雜的化合物。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等類型。次級代謝：初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝系統(tǒng)、代謝途徑和初級代謝產物在各類生物中基本相同。它是一類普遍存在于各類生物中的一種基本代謝類型。(1)(1)存在范圍及產物類型不同存在范圍及產物類型不同象病毒這類非細胞生物雖然不具備完整的初級代謝系統(tǒng)，但它們象病毒這類非細胞生物雖然不具備完整的初級代謝系統(tǒng)，但它們仍具有部分的初級代謝系統(tǒng)和具有利用宿主代謝

15、系統(tǒng)完成本身的仍具有部分的初級代謝系統(tǒng)和具有利用宿主代謝系統(tǒng)完成本身的初級代謝過程的能力。初級代謝過程的能力。次級代謝只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且次級代謝只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且代謝途徑和代謝產物因生物不同而不同，就是同種生物也會由代謝途徑和代謝產物因生物不同而不同，就是同種生物也會由于培養(yǎng)條件不同而產生不同的次級代謝產物。于培養(yǎng)條件不同而產生不同的次級代謝產物。例如某些青霉、芽孢桿菌和黑曲霉在一定的條件下可以分別合成例如某些青霉、芽孢桿菌和黑曲霉在一定的條件下可以分別合成青霉素、桿菌肽和檸檬酸等次級代謝產物。青霉素、桿菌肽和檸檬酸等次級代謝產物。不同的

16、微生物可產生不同的初級代謝產物不同的微生物可產生不同的初級代謝產物相同的微生物在不同條件下產生不同的初級代謝產物相同的微生物在不同條件下產生不同的初級代謝產物用于青霉菌的二種培養(yǎng)基：用于青霉菌的二種培養(yǎng)基：raulinraulin培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：葡萄糖葡萄糖5%5%、酒石酸、酒石酸0.27%0.27%、酒石酸銨、酒石酸銨0.27%0.27%、磷酸氫二銨、磷酸氫二銨0.04%0.04%、硫酸鎂、硫酸鎂0.027%0.027%硫酸銨硫酸銨0.017%0.017%、硫酸鋅、硫酸鋅0.005%0.005%、硫酸亞鐵、硫酸亞鐵0.005%0.005%czapekczapekdoxdox培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：葡

17、萄糖葡萄糖5%5%、硝酸納、硝酸納0.2%0.2%、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀0.1%0.1%、氯化鉀、氯化鉀0.05%0.05%、硫酸、硫酸鎂鎂0.05%0.05%、硫酸亞鐵、硫酸亞鐵0.001%0.001%灰黃青素在灰黃青素在czapekczapekdoxdox培養(yǎng)基上培養(yǎng)時可以合成灰黃霉素，培養(yǎng)基上培養(yǎng)時可以合成灰黃霉素，在在raulinraulin培養(yǎng)基上培養(yǎng)時則合成褐菌素（培養(yǎng)基上培養(yǎng)時則合成褐菌素（fulvicfulvic acid acid）；）；penicillium urticaepenicillium urticae在含有在含有0.50.51010-8-8m m的鋅離子的的鋅離

18、子的czapekczapekdoxdox培培養(yǎng)基里培養(yǎng)時合成的主要次級代謝產物是養(yǎng)基里培養(yǎng)時合成的主要次級代謝產物是6-6-氨基水楊酸，但在含氨基水楊酸，但在含0.50.51010-6-6m m的鋅離子的的鋅離子的czapekczapekdoxdox培養(yǎng)基里培養(yǎng)時不合成培養(yǎng)基里培養(yǎng)時不合成6-6-氨氨基水楊酸，但可以合成大量的龍膽醇、甲基醌醇和棒曲霉素。基水楊酸，但可以合成大量的龍膽醇、甲基醌醇和棒曲霉素。產黃青霉在在產黃青霉在在raulinraulin中培養(yǎng)時可以合成青霉酸。但在中培養(yǎng)時可以合成青霉酸。但在czapekczapekdoxdox中培養(yǎng)則不產青霉酸。中培養(yǎng)則不產青霉酸。次級代謝產

19、物雖然也是從少數(shù)幾種初級代謝過程中產生的中間體次級代謝產物雖然也是從少數(shù)幾種初級代謝過程中產生的中間體或代謝產物衍生而來，但它的骨架碳原子的數(shù)量和排列上的微小或代謝產物衍生而來，但它的骨架碳原子的數(shù)量和排列上的微小變化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在產物氧化水平上的變化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在產物氧化水平上的微小變化都可以導致產生各種各樣的次級代謝產物，并且每種類微小變化都可以導致產生各種各樣的次級代謝產物，并且每種類型的次級代謝產物往往是一群化學結構非常相似的不同成分的混型的次級代謝產物往往是一群化學結構非常相似的不同成分的混合物。例如，目前已知的新霉素有合物。例如，目前已知

20、的新霉素有4 4種，桿菌肽、多粘菌素分別有種，桿菌肽、多粘菌素分別有有有1010多種，而放線菌素有多種，而放線菌素有2020多種等。多種等。初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝與初級代謝的關系：1 1、存在范圍及產物類型不同、存在范圍及產物類型不同2 2、對產生者自身的重要性不同、對產生者自身的重要性不同初級代謝產物，如單糖或單糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等單體初級代謝產物，如單糖或單糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等單體以及由它們組成的各種大分子聚合物，蛋白質、核酸、多糖、以及由它們組成的各種大分子聚合物，蛋白質、核酸、多糖、脂類等通常都是機體生存必不可少的物質，只要在這些物質的脂類等通常都是機體生存必不

21、可少的物質，只要在這些物質的合成過程的某個環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長停止、重則導合成過程的某個環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長停止、重則導致機體發(fā)生突變或死亡。致機體發(fā)生突變或死亡。次級代謝產物對于產生者本身來說，不是機體生存所必需的物質次級代謝產物對于產生者本身來說，不是機體生存所必需的物質，即使在次級代謝的某個環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙。不會導致機體生長的，即使在次級代謝的某個環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙。不會導致機體生長的停止或死亡，至多只是影響機體合成某種次級代謝產物的能力。停止或死亡，至多只是影響機體合成某種次級代謝產物的能力。次級代謝產物一般對產生者自身的生命活動無明確功能，不是機次級代謝產物一般對產生者自身

22、的生命活動無明確功能，不是機體生長與繁殖所必需的物質，也有人把超出生理需求的過量初級體生長與繁殖所必需的物質，也有人把超出生理需求的過量初級代謝產物也看作是次級代謝產物。代謝產物也看作是次級代謝產物。次級代謝產物通常都分泌到胞外，有些與機體的分化有一定的關次級代謝產物通常都分泌到胞外，有些與機體的分化有一定的關系，并在同其它生物的生存競爭中起著重要的作用。系，并在同其它生物的生存競爭中起著重要的作用。許多次級代謝產物通常對人類和國民經濟的發(fā)展有重大影響。許多次級代謝產物通常對人類和國民經濟的發(fā)展有重大影響。初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝與初級代謝的關系：(1)(1)、存在范圍及產物類型不同

23、、存在范圍及產物類型不同(2)(2)、對產生者自身的重要性不同、對產生者自身的重要性不同(3)(3)、同微生物生長過程的關系明顯不同、同微生物生長過程的關系明顯不同初級代謝自始至終存在于一切生活的機體中，同機體的生長初級代謝自始至終存在于一切生活的機體中，同機體的生長過程呈平行關系；過程呈平行關系；次級代謝則是在機體生長的一定時期內（通常是微生物的對數(shù)生次級代謝則是在機體生長的一定時期內（通常是微生物的對數(shù)生長期末期或穩(wěn)定期）產生的，它與機體的生長不呈平行關系，一長期末期或穩(wěn)定期）產生的，它與機體的生長不呈平行關系，一般可明顯地表現(xiàn)為機體的生長期和次級代謝產物形成期二個不同般可明顯地表現(xiàn)為機體

24、的生長期和次級代謝產物形成期二個不同的時期。的時期。初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝與初級代謝的關系：(1)(1)、存在范圍及產物類型不同、存在范圍及產物類型不同(2)(2)、對產生者自身的重要性不同、對產生者自身的重要性不同(3)(3)、同微生物生長過程的關系明顯不同、同微生物生長過程的關系明顯不同(4)(4)、對環(huán)境條件變化的敏感性或遺傳穩(wěn)定性上明顯不同、對環(huán)境條件變化的敏感性或遺傳穩(wěn)定性上明顯不同初級代謝產物對環(huán)境條件的變化敏感性小（即遺傳穩(wěn)定性大），初級代謝產物對環(huán)境條件的變化敏感性小（即遺傳穩(wěn)定性大），而次級代謝產物對環(huán)境條件變化很敏感，其產物的合成往往因環(huán)而次級代謝產物對環(huán)境條件

25、變化很敏感，其產物的合成往往因環(huán)境條件變化而停止。境條件變化而停止。初級代謝與初級代謝的關系：初級代謝與初級代謝的關系：1 1、存在范圍及產物類型不同、存在范圍及產物類型不同2 2、對產生者自身的重要性不同、對產生者自身的重要性不同3 3、同微生物生長過程的關系明顯不同、同微生物生長過程的關系明顯不同4 4、對環(huán)境條件變化的敏感性或遺傳穩(wěn)定性上明顯不同、對環(huán)境條件變化的敏感性或遺傳穩(wěn)定性上明顯不同(5)(5)、相關酶的專一性不同、相關酶的專一性不同相對來說催化初級代謝產物合成的酶專一性強，催化次級代謝相對來說催化初級代謝產物合成的酶專一性強，催化次級代謝產物合成的某些酶專一性不強，因此在某種次級代謝產物合成產物合成的某些酶專一性不強，因此在某種次級代謝產物合成的培養(yǎng)基中加入不同的前體物時，往往可以導致機體合成不同的培養(yǎng)基中加入不同的前體物時，往往可以導致機體合成不同類型的次級代謝產物，類型的次級代謝產物，另外，催化次級代謝產物合成的酶往往是一些誘導酶，它們是另外，催化次級代謝產物合成的酶往往是一些誘導酶，它們是在產生菌對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期里，由于某種中間代謝產在產生菌對數(shù)生長末期或穩(wěn)定