.,實驗研究的目的性功能、形態、數量實驗設計的科學性全面、動態、鮮明、對應、對照實驗方法的合理性確切、先進實驗原理的內涵性意義、要點實驗操作的規范性準備、嚴格、準確、重復,.,免疫血清和單克隆抗體的制備,.,一、免疫血清的制備1.原理：機體具有多種B細胞克隆，將適當的抗原物質注入人或動物體內后可被不同的B細胞克隆同時識別，經過一定時間，受刺激的B細胞克隆針對抗原表位的多少而產生相應的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發相應B細胞克隆產生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。優質免疫血清的產生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動物的免疫應答能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數、時間間隔和有無佐劑等因素。,.,免疫原1.抗原種類微生物抗原、組織抗原和免疫球蛋白抗原。2.抗原純度一般的抗原只要達到親合層析或SDSPAGE電泳純即可。3.抗原用量在一定范圍內與免疫應答強度呈正相關。在應用完全弗氏佐劑時，蛋白質類抗原劑量以0.51mg/kg體重為宜，加強免疫約為基礎劑量的1/21/3。,.,4.抗原的處理1）顆粒性抗原：紅細胞、菌體等制成懸液，不需佐劑，直接免疫。菌體數11010個/ml為宜。2）可溶性蛋白質抗原（如人IgG）、病毒抗原、細菌可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑（1：1V/V）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化學藥品）需與載體偶聯。常用載體有牛血清白蛋白（BSA）、鑰孔嘁血藍素(KLH)、雞血清蛋白（OA）；偶聯劑有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。KLH是最常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯劑。,.,佐劑1.概念佐劑屬非特異性免疫增強劑，與抗原一起注射或預先注入機體時，可增強機體免疫應答或改變免疫應答的類型。2.種類1）卡介苗（BCG）、短小棒狀桿菌（CP）、脂多糖（LPS）、細胞因子；2）氫氧化鋁、明礬；3）雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）和雙鏈多聚腺苷酸：鳥苷酸（polyA：U）；4）礦物油、脂質體、免疫刺激復合物（ISCOMs）、CPG寡核苷酸。,.,3.弗氏完全佐劑1）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液體石蠟為1：2，也可1：1。滅活卡介苗（220mg/ml）。4.弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐劑。5.用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。,.,動物選擇對免疫動物的主要要求有：1.應選擇與抗原物質親緣關系遠的動物，特別是在制備抗免疫球蛋白血清時更要注意?？乖镔|的來源生物與被免疫動物親緣關系越遠，免疫應答能力越強，抗體產生水平越高，抗體親和力也越強。2.動物生理狀態正常，發育成熟，體重符合規定。家兔初始免疫體重通常在22.5kg。3.性別上以雄性成年動物較常用，也可采用雌性非妊娠動物。不能應用患病或剛剛病愈、有免疫缺陷或應用免疫抑制劑的動物。,.,免疫方法1.免疫途徑1）注射方法：靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內和淋巴結等。2）免疫方法：小劑量、多點、多途徑方法。3）顆粒性抗原（細菌懸液、紅細胞懸液）采用小鼠腹腔注射。4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐劑的乳劑（油包水型），家兔背部多點皮下注射法。,.,2.可溶性抗原免疫1）方法：基礎免疫（初次免疫）后三周左右，進行加強免疫，以后每隔2周加強免疫一次。2）加強免疫次數取決于試血結果。家兔耳緣靜脈、小鼠眶靜脈少量采血，分離血清，免疫雙擴實驗測定血清效價1：32或ELISA法測定抗體效價1：10000，表明抗體效價較高，可采兔頸動脈或心臟全部血液，分離血清。4）如抗體效價較低，繼續加強免疫，一般需45次。若仍不能達到抗體效價要求，應考慮重新免疫。3.顆粒性抗原免疫第一周注射2次，隨后每周加強免疫1次，45天試血。,.,3.操作程序1）健康雄性家兔體重2.53kg，背部皮下多點注射。2）基礎免疫：抗原完全佐劑(抗原劑量4mg/只)2ml(1:1V/V)吸入兩支注射器內，三通連接，反復推拉混合至乳化懸液。3）加強免疫：抗原不完全佐劑(抗原劑量2.5mg/只)，間隔710天加強一次。約23次。4）試血：末次注射后第7天取少量靜脈血，免疫雙擴試驗血清檢測，抗血清效價1：32（或ELISA法檢測抗體效價1：10，000）時頸動脈放血，分離血清，分裝，保存。,.,二單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無性繁殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術，這項技術上的突破使血清學的研究進入了一個高度準確的新紀元。,.,1.原理根據致敏的單一B細胞克隆具有分泌特異性抗體和骨髓瘤細胞在體外長期增殖的特性，采用細胞融合技術在體外可將上述兩種細胞融合形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞因具備了B細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，即可分泌抗體，又能在HAT培養基中長期存活。因此，可通過HAT選擇性培養，篩選出克隆化目的雜交瘤細胞株，再利用雜交瘤細胞培養上清或雜交瘤細胞接種小鼠產生的腹水，獲取大量的來源于雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）。,.,2.試劑與器材（1）細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/LL-谷氨酰胺貯存液（3）200雙抗（青、鏈霉素）溶液（4）RPMI-1640培養液（5）15%胎牛血清RPMI-1640培養液（6）100氨基蝶呤（A）貯存液（7）100次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液（8）1HAT培養液（9）1HT培養液（10）1008-雜氮鳥嘌呤貯存液,.,（11）細胞凍存液：90ml含30%FCS的RPMI-1640培養液+10mlDMSO（12）0.2MpH7.4磷酸鹽緩沖液（13）主要儀器設備：CO2培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、離心機、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾器、酶聯免疫測定儀等。（14）常規實驗器材：血細胞記數板、各種吸管、離心管、細胞培養瓶、培養皿、24孔和96孔培養板、細胞凍存管、注射器、微量移液器等。（15）抗體純化器材與試劑。（16）小鼠實驗器材：手術剪刀、鑷子等解剖器材。（17）骨髓瘤細胞：小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0或NS-1。,.,3.實驗流程（1）實驗動物免疫：BALB/c小鼠，雌性，68W。常規免疫方案：0、15、30天，72h后制備脾細胞懸液。基礎免疫：10100g抗原(可溶性抗原)完全佐劑0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多點注射。加強免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔710天一次。約23次，皮下或腹腔注射。試血：取靜脈血，ELISA法檢測血清中抗體滴度，當效價達到1：400以上時，進行加強免疫。弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。,.,（2）免疫動物脾細胞懸液的制備：將末次免疫后3天BALB/c小鼠處死，消毒，無菌取出脾臟，置入無菌PBS或培養液中。在100目的鋼網上研磨脾臟。收集細胞于50ml離心管中，1500rpm離心5分，去上清。加入10mlPBS用吸管輕微混勻，1500rpm離心5分，去上清，用10mlRPMI培養液懸浮。細胞計數（細胞數/ml=N/4104稀釋倍數）用1640培養液調整細胞濃度至1108/ml,.,（3）飼養細胞制備在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其他活細胞則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的細胞稱飼養細胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細胞。將正常BALB/c小鼠腹部消毒后，注射預冷的無血清培養液5ml，輕揉腹部數次，于腹部左下處剪開腹膜，吸取細胞懸液，反復23次，用培養液離心洗滌2次。用15%FCS-RPMI-1640調細胞濃度為2105/ml，將細胞接種于96孔培養板，100l/孔。,.,（4）骨髓瘤細胞的準備復蘇骨髓瘤細胞用10FCS-RPMI-1640培養液培養1周，23天換液一次，依細胞生長情況34天傳代一次，適宜密度3105/ml。融合之前3天，每天換一半培養液，使細胞保持在對數生長期。取對數生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗2次，調細胞濃度為12107/ml備用。,.,（5）細胞融合1）將骨髓瘤細胞與脾臟細胞按1：10或1：5的比例混合，在50ml離心管中用無血清培養液洗1次，離心棄上清；2）1min內加入37預溫的1ml50PEG溶液，邊加邊搖37水浴1min；3）加37預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；4）離心，棄上清，用含20小牛血清HAT選擇培養液重懸；5）將上述細胞加入已有飼養細胞的96孔培養板內，每孔100l，放入375CO2培養箱培養。,.,（6）融合細胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測細胞培養3天后，使用HAT培養液換液；3天后，再次使用HAT培養液換液。當細胞克隆集落大于3mm時，利用間接ELISA法篩選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞克隆。,.,（7）雜交瘤細胞克隆化將分泌單克隆抗體陽性的雜交瘤細胞克隆按有限稀釋法稀釋細胞（用HAT培養液稀釋細胞），于96孔培養板中加入0.1ml/孔，培養2周，利用間接ELISA法挑選單個陽性雜交瘤細胞克隆孔并再次進行亞克隆，直至亞克隆時全部克隆孔細胞培養上清中抗體檢出陽性率為100%為止。,.,（8）雜交瘤細胞凍存與復蘇將陽性細胞克隆在培養板或培養瓶中擴大培養，收集細胞，離心1000轉、5分，棄上清，加入細胞凍存液，移至凍存管，-70冰箱過夜，然后液氮長期保存。將凍存管從液氮中取出，立即放入37水浴中，使之迅速融化。用培養液洗滌1次后，加入培養液繼續培養。,.,（9）單克隆抗體的大量制備BALB/c雌性小鼠接種雜交瘤細胞前12周，腹腔注射降植烷預處理。用無血清培養液洗滌雜交瘤細胞23次，調細胞濃度12106/ml，每只小鼠腹腔注射0.51ml細胞懸液。待小鼠腹部明顯膨大時，收集腹水，離心，收集上清，分裝，-80保存。,.,（10）單克隆抗體純化鹽析法腹水10ml等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸胺20ml，4放置0.5h以上或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加生理鹽水20ml溶解后，再次加入飽和硫酸胺10ml，4放置0.5h或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加盡量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動自來水透析40min，再用生理鹽水透析24h，中間換液34次，檢測無NH4離子存在即可。-20備用。,.,凝膠柱層析實驗原理：凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯劑作用下形成三維空間網狀結構，蛋白質溶液流經凝膠柱時，根據蛋白質分子量的大小不同，由大到小洗脫而進行分離。（大分子蛋白質不能進入凝膠粒內部，在膠粒間隙隨洗脫液最先流出。而小分子蛋白質進入膠粒內部洗脫較慢。）關鍵點：1.裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱；2.加樣時緩沖液面恰好在濾紙片上，及時加樣避免柱干涸，干涸凝膠不能繼續使用；3.因操作時間長，宜在4操作，防止影響免疫球蛋白活性。,.,（11）單克隆抗體免疫學性質檢定1）單克隆抗體特異性測定；2）單克隆抗體亞類測定；3）單克隆抗體效價測定；4）親和力測定；5）識別抗原表位的測定。,.,.,4.單克隆抗體制備的幾處要點：1）相對分子量為4000的PEG融合效率最高。2）免疫原性較強的抗原可不用佐劑，但一般可溶性蛋白抗原免疫時需要佐劑，并且乳化要充分。一般多采用背部多點注射法