一、 限制性核酸內切酶及其應用(一)限制性核酸內切酶的發現當(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能識別已甲基化的序列。最早分離出的限制內切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒有實用價值。首個II型限制內切酶是在1970年，由H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。從此，相關研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內切酶中，其中有30%是在NEB發現的 。限制性核酸內切酶(restriction endonuclease )：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。切開的是3，5-磷酸二酯鍵。(二)限制性核酸內切酶的分類分為I型、II型和III型。(三)限制性核酸內切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin;2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind;3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數字標出，比如Eco R I、 Hin。d III(四) II型限制性核酸內切酶的基本特性1、識別位點的特異性每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由48個核苷酸組成的特定序列(靶序列)。2、識別序列的對稱性靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。3、切割位點的規范性交錯切或對稱切(可形成粘性末端或平末端的DNA分子)。與II型核酸內切酶有關的幾個概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。平 末 端 ：Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產生的平齊末端結構。則不易于重新環化。同裂酶：isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。同尾酶：isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一組同尾酶。注 意： 由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。(五)限制性核酸內切酶的消化反應一個限制酶單位(U)指：在理想的反應條件(適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37)下，1h內中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的純度 DNA的甲基化程度酶切反應的溫度(通常為37 )DNA的分子結構 核酸內切限制酶的緩沖液在“非最適的”反應條件下,有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現象叫星號活性。用*表示。二、 DNA連接酶及其應用(一)DNA連接酶的發現環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。首個DNA連接酶(ligase)大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發現的，是大腸桿菌基因編碼。1970年，發現了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。(二) DNA連接酶作用特點1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3-OH和5-P，而且這兩個基團彼此相鄰;2. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。E.coli DNA連接酶 -連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明)，現在研究可連接平末端;需NAD+輔助因子，活性低，不常用。T 4DNA連接酶-連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。(三) DNA連接酶的反應條件影響連接效率的因素有：1. 溫度(通常在4-15 )2. ATP的濃度(10M/L - 1mM/L )3. 連接酶濃度(一般平末端大約需12U，黏性末端僅需0.1U)4. 反應時間(通常連接過夜)5. 插入片段和載體片段的摩爾比( 1151)(四)T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案1.連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。2.10l體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子(一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1151)，補足ddH2O 至8l。3.輕輕混勻，稍加離心，56水浴5min后，迅速轉入冰浴。4.加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10l，稍加離心，在適當溫度(一般14-16)連接8-14hr。三、DNA聚合酶及其應用(一)大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：5 3聚合酶活性(模板， 帶3-OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ )。雙鏈特異性的53核酸外切酶活性。35核酸外切酶活性。從游離的雙鏈或單鏈DNA的3端降解。不過對于雙鏈的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途1.利用缺口轉移法制備高比活度的DNA探針利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。2.用于DNA連接前的大缺口填充利用5-3的聚合酶活性。3.用于DNA的序列分析利用5-3的聚合酶活性。(二)Klenow片段酶Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生的大片段酶分子，分子量為76KD 。酶催活性：5 3 的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途(利用5 3 的聚合酶活性)：修補限制性酶消化DNA形成的3隱蔽末端標記DNA片段的末端底物用-32P-dNTPscDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測定(三)T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，1.酶催活性：53的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強1001,000倍。因此，可以綜合利用這兩種活性進行取代合成反應：如果反應體系中僅存在一種dNTP或沒有底物時，這時T4DNA聚合酶就會表現出3 5 外切酶活力，從雙鏈DNA的3開始降解，直到露出底物dNTP相同的堿基。然后就在此位置發生合成和取代反應。2.T4DNA聚合酶的用途(1)利用取代合成反應制備探針(2)標記具有平末端的或具有3-隱蔽末端的DNA片段利用較強的3 5 外切酶活性和 53聚合活性(3)用于DNA序列分析(四)逆轉錄酶(反轉錄酶)逆轉錄酶 是一種依賴RNA的DNA聚合酶。此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發現的。這兩個課題組的論文都發在了同一期的Nature雜志上。最普遍使用的是從鳥類骨髓母細胞瘤病毒(AMV)分離出來的。活性：一種可以有效地將mRNA反轉錄成DNA的酶，其產物稱為cDNA(complementary DNA).主要用途是 將mRNA轉錄成cDNA以制備基因片段。四、修飾性工具酶(一)末端轉移酶(terminal transferase)l 末端轉移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。l 特性：該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到dsDNA或ssDNA的在3-OH。特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有用。l 最常見的用途：給外源DNA片段及載體分子加上互補的同聚物尾巴，以創造黏性末端，便于重組。(二) SI核酸酶(SI nuclease)這是一種從米曲霉(Aspergillus oryzae)中分離的高度單鏈特異的外切酶。活性：可以降解單鏈DNA或RNA或雙鏈的單鏈區。其主要用途有：在cDNA合成過程中，切開cDNA的發夾末端;載體構建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，形成平末端結構。(三)堿性磷酸酶從大腸桿菌中分離的細菌堿性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosp