濕熱滅菌工藝驗證 第 1 頁 共 25 頁 濕熱滅菌工藝驗證方案濕熱滅菌工藝驗證方案 山東鑫科生物科技有限公司山東鑫科生物科技有限公司 濕熱滅菌工藝驗證 第 2 頁 共 25 頁 目錄 1 引言 3 2 滅菌設備和公用系統的測試 3 2 1 滅菌柜特性 3 2 2 滅菌介質 4 2 3 容器類別 4 2 4 設備壓力表 安全閥等合格證 5 2 5 其他合格證見附圖 5 3 空熱載和熱穿透實驗 6 3 1 滅菌工作程序 6 3 2 滅菌對象 6 3 3 驗證目的 6 3 4 實驗過程 6 3 4 1 滅菌柜準備階段 6 3 4 2 操作步驟 7 3 4 3 熱載實驗 7 3 4 4 培養液在滅菌柜內的排放 7 3 4 5 探頭在滅菌室內的排放 8 3 4 6 實驗結果 9 3 5 熱穿透試驗 3 5 1 驗證步驟 3 5 2 合格標準 3 5 3 實驗結果 10 3 5 4 結果分析 4 生物指示劑實驗 4 1 生物指示劑說明 4 2 生物指示劑實驗步驟 4 3 實驗結果 4 4 驗證合格標準 4 5 結果分析及評價 4 6 偏差及評估意見 5 附圖 濕熱滅菌工藝驗證 第 3 頁 共 25 頁 1 引言 概述 本公司采用張家港市環宇制藥設備有限公司生產的 MQS0 25 型滅菌柜 張 家港市環宇制藥設備有限公司始建于 2001 年 是國內滅菌柜設計制造領域的佼 佼者 公司擁有 D1 D2 壓力容器制造許可證 醫療器械生產企業許可證 通過 了 ISO9001 質量管理體系認證 所生產的各種消毒滅菌設備涵蓋了制藥 醫療 生物 食品等領域 符合國家 GMP 驗證和特種設備安全監察 衛生防疫等部門 的相關要求 本公司主要對瓶裝液體培養基進行消毒 該滅菌柜采用飽和蒸汽的方式進行 滅菌 該設備廣泛適用于制藥 醫療 科研等行業對生物制品 醫療器械 無 菌衣物 工器具 器皿 培養基等物品的高溫滅菌操作和冷卻干燥處理 性能簡介 該設備嚴格按照壓力容器規范 GB150 和 脈動真空滅菌柜 標準設計制作 主體為臥式矩形內外雙層結構 前期采用脈動真空排氣方式消除滅菌室內殘存 冷空氣對溫度的影響 排除率 99 既加快了升溫速度 減少了對被滅菌物 品的損傷 又充分保證了滅菌溫度均勻性 滅菌后真空抽濕結合套層烘干使物 品干燥和冷卻 滅菌器裝載能力 50ml 420 瓶 2 滅菌設備和公用系統的測試 2 12 1 滅菌柜特性滅菌柜特性 濕熱滅菌工藝驗證 第 4 頁 共 25 頁 濕熱滅菌工藝驗證 第 5 頁 共 25 頁 2 2 滅菌介質 飽和水蒸汽 調制 0 5 麥氏的菌懸液 放入玻璃瓶中 放入蒸汽式 的高壓鍋 121 高壓 30min 后 將細菌轉種到細菌培養基中 培養 48 小時 沒有細菌 生長 說明高壓蒸汽滅菌有效 2 3 容器類別為一類 套層和內層溫度和壓力試驗 見滅菌柜產品技術特性 符合標準 GB150 1998 YY T0084 2 92 JB T4709 2000 容規 因此此設備 壓力設計安全 2 4 該設備壓力表 安全閥等合格證如圖 濕熱滅菌工藝驗證 第 6 頁 共 25 頁 2 5 其他合格證明見附圖 3 空熱載和熱穿透實驗 3 1 滅菌工作程序 準備階段 打開蒸汽 自來水 壓縮空氣等能源管道上的閥門 每天第一 次使用前排除蒸汽管道內的冷凝水 確認各種能源壓力符合設備工作要求 打 開電器箱中得電源開關并確認正常 操作階段 打開電源 確認觸摸屏進入主操作界面 設定參數 然后按門 操作鍵進入門操作界面 打開門后裝入滅菌對象 關閉前門 啟動階段 在主操作界面上 按自動 手動選擇鍵 選擇滅菌程序 確認后 進入滅菌階段 結束階段 滅菌完成后 在主操作界面按門操作鍵進入門操作界面 解除 門密封狀態 然后在后操作界面上 按開門鍵 打開后門 取出滅菌后的物品 最后 在后操作面板上按關門鍵 關閉后門 至此 完成一個滅菌周期 清潔階段 清洗滅菌室 關閉各種能源閥門 關閉電源 本方案依據濕熱滅菌的指導原則制訂 主要進行設備滅菌程序的驗證 3 2 滅菌對象 本公司主要生產臨床檢驗細菌用的試劑盒 培養瓶 以及配套的培養液與 稀釋液 需要高壓滅菌的主要是培養液與稀釋液 培養液成分 重蒸水 腦心浸液 濃度為3 7 稀釋液成分 重蒸水 氯化鈉 濃度為9 原材料名稱廠家名稱規格批號 腦心浸液英國OXOID公 司 500g 瓶 1079013 氯化鈉天津市大茂化 學試劑廠 500g 瓶 20100508 腦心浸液主要作用是為細菌提供碳源及氮源 高溫高壓下對其沒有影響 氯化鈉主要為稀釋細菌用 并且高溫高壓下氯化鈉化學性質穩定 因此這兩種物質適于高壓高溫滅菌的方法 3 3 驗證目的 安裝確認主要檢查滅菌柜安裝符合設計要求 滅菌柜有關資料和文件符合 GMP 的管理要求 運行確認主要檢查滅菌柜各單元的性能及整機運行是否達到供貨單位設計 要求 性能確認主要驗證滅菌柜在裝載情況下不同位置的熱分布狀況 確定滅菌 柜中冷點的位置 確定產品滅菌程序有關的參數 如溫度 壓力及滅菌時間等 以確保產品滅菌后達到低于10 6 的微生物污染率 同時驗證滅菌器運行的可靠 性及滅菌程序的重現性 3 4 實驗過程 滅菌柜準備階段 3 4 1 在打開電源之前 必須做好準備工作 1 檢查設備狀態是否良好 2 打開自來水閥門 包括進水泵用自來水和真空用自來水 3 關閉水箱排放閥 4 檢查空氣壓縮機放氣閥是否已關閉 關閉后再打開空氣壓縮 濕熱滅菌工藝驗證 第 7 頁 共 25 頁 機 壓縮機工作幾分鐘后 達到設定壓力 停止工作 看壓縮機上壓力表讀數 是否在0 5 0 8Mpa范圍內 再看滅菌柜上進氣口處壓力表讀數是否也在 0 5 0 8Mpa范圍內 都正常后再進行下面操作 3 4 2 操作步驟 1 打開控制電源 按下主操作面板上的電源按鈕 確認觸摸屏 后進入主操作界面 此時 PLC上電后先檢測四個門接近開關是否都亮燈 若都 亮 開始往水箱注水 大約一分鐘后 顯示低液位 并顯示制蒸汽 大約再過 一分鐘 顯示高液位 停止進水 進水時間一般不超過三分鐘 若超過三分鐘 檢查設備是否有異常情況 進水過程中 觀察套層壓力表讀數變化 若其讀數 超過0 2Mpa 為不正常 此時應關閉設備電源 打開水箱排放閥 2 參數設置 在參數設定界面上 按工藝要求設定好工作壓力 滅菌溫度 滅菌時間 干燥時間等工作參數 選擇好所用滅菌程序 參數設定 完成并確認無誤后 按該界面的確定鍵返回主操作界面 3 物品裝載 在門操作界面上 按開前門鍵 打開設備前門 將 待滅菌物品從前門裝入滅菌室內 裝載完成后 關閉前門 確認前門已關好 且該界面前 后門關閉指示燈顯示正常 按該界面上的門密封鍵并確認門密封 指示正常 4 啟動滅菌程序 在主操作界面上 按自動鍵 選擇自動程序 按啟動鍵 設備開始按選定的設定程序運行 自動進行滅菌操作 滅菌過程中 應注意各參數變化情況 以及設備運行情況 若出現異常 應根據情況 采取 適當措施 滅菌結束后套層開始排放蒸汽 待滅菌室壓力降低到70Kpa左右時 停止程序 然后 選擇手動程序 按其中的排放鍵 滅菌室開始排放蒸汽 其 壓力逐漸降低到10Kpa左右 再點動按真空鍵 讓滅菌室壓力降到0 5 物品卸載 在主操作界面按門操作鍵進入門操作界面 在該界 面上 按門真空鍵3 5秒 以解除門密封狀態 然后按開前門鍵 打開前門 取 出滅菌后的物品 6 設備使用結束后 清潔滅菌室及設備 關閉電源 關閉自來水 閥門 關閉壓縮機 打開水箱排放閥 打開壓縮機放氣閥 3 4 3 熱載實驗 1 首先空載運行三次驗證滅菌柜內溫度的均勻性 2 將瓶裝培養液密封后 排放在不銹鋼托盤上 每瓶之間留有3cm的 空間放入滅菌室 作為最小裝載運行三次 每次都是完全冷卻后再運行第二次 3 將瓶裝培養液密封后 排放在不銹鋼托盤上 每瓶之間不留空間 放入滅菌室 作為最大裝載運行三次 每次都是完全冷卻后再運行第二次 4 將瓶裝培養液密封后 排放在不銹鋼托盤上 每瓶之間留有1cm的 空間放入滅菌室 典型裝載運行三次 每次都是完全冷卻后再運行第二次 5 記錄每次實驗各點的溫度 3 3 4 培養液在滅菌柜內的排放 如下圖 濕熱滅菌工藝驗證 第 8 頁 共 25 頁 3 4 5 探頭在滅菌室內的排放 數字代表幾個探頭的位置如下圖 濕熱滅菌工藝驗證 第 9 頁 共 25 頁 探頭采用北京賽億凌科技有限公司生產的STT R系列鉑電阻溫度傳感器 溫度 檢測范圍為 50 250 精度為0 1 3 4 6 實驗結果 項目最冷點和腔室平均溫度差值 濕熱滅菌工藝驗證 第 10 頁 共 25 頁 空載熱分布 第一次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 空載熱分布 第二次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 空載熱分布 第三次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 裝載熱分布 最小裝載 第一次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 裝載熱分布 典型裝載 第一次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 裝載熱分布 最大裝載 第一次 各個點平均差值1 0 靠近管壁與熱源處溫度較高 其他部位 基本一致 裝載熱分布 最小裝載 第二次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 裝載熱分布 典型裝載 第二次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 裝載熱分布 最大裝載 第二次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 裝載熱分布 最小裝載 第三次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 裝載熱分布 典型裝載 第三次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 裝載熱分布 最大裝載 第三次 各個點平均差值在2 0 靠近管壁與進氣孔處溫度較高 其他 部位基本一致 方案實施 崔陳波 日期 2011 3 20 3 5 熱穿透試驗 滅菌程序的驗證 與生物指示劑同時進行 目的 熱穿透試驗是在熱分布試驗的基礎上 確定裝載中的 最冷點 并確 認該點在滅菌過程中獲的F0不小于8 3 5 1 驗證步驟 濕熱滅菌工藝驗證 第 11 頁 共 25 頁 測試過程 將1支探頭置于由熱分布試驗確定的冷點位置 其余探頭按溫度 探頭裝載圖均勻分布在滅菌產品中并固定好 鉑電阻安裝時不要與塑料袋接觸 記下探頭編號 關上滅菌柜的門 運行滅菌程序 啟動驗證儀記錄滅菌溫度 F0 每30s 采集一次 直到滅菌程序結束 裝載類型 10 ml螺口瓶裝培養液 包含最小裝載 典型裝載和最大裝載三 種 每種重復三次 以檢查其重現性 滅菌程序 121 30 min 3 5 2 合格標準 對于此滅菌程序產品來說 腔室內各點 包括最冷點 F0 8 冷點F0值和 產品F0 的平均值之間的差值不超過2 5 3 5 3 實驗結果 項目最冷點F F0 0差值 裝載熱穿透 最小裝載 第一次 8 40 1 裝載熱穿透 典型裝載 第一次 8 10 4 裝載熱穿透 最大裝載 第一次 8 90 4 裝載熱穿透 最小裝載 第二次 8 20 3 裝載熱穿透 典型裝載 第二次 8 30 2 裝載熱穿透 最大裝載 第二次 9 00 5 裝載熱穿透 最小裝載 第三次 8 20 3 裝載熱穿透 典型裝載 第三次 8 40 1 裝載熱穿透 最大裝載 第三次 9 00 5 3 5 4 結果分析 實驗結果符合標準 驗證合格 濕熱滅菌工藝驗證 第 12 頁 共 25 頁 4 生物指示劑試驗 4 1 生物指示劑說明 生物指示劑 生物指示劑是一類特殊的活微生物制品 可用于確認滅菌設備的性 能 滅菌程序的驗證 生產過程滅菌效果的監控等 對特定滅菌處理有確定的抗力 并裝在內 層包裝中可供使用的染菌載體 生物指示劑重量質量特性 a 芽孢含量 b D值 本次使用的指示劑為四環牌ME 壓力蒸汽滅菌生物指示劑 由軍事醫學科學院微生物 流行病研究所研制 北京四環衛生藥械廠有限公司出品 生產地址 北京市豐臺區東大街 20號 型號為ME 型 批準文號 衛消字 2002 第0146號 執行標準 Q SHY 03 2002 衛生許可證 京衛消證字 2002 第0055號 ISO9001 2000國際質量管理體系認證企 業 批號 20110406 本品由嗜熱脂肪桿菌芽孢 ATCC7953 菌片 培養基 密封在玻璃管 內 及塑料外殼組成自含式生物指示劑 菌片含菌量為5 10 5 5 10 6cfu 片 D值為 1 3 1 9分鐘 在121 0 5 飽和蒸汽條件下 存活時間 3 9分鐘 殺滅時間 19分鐘 該 產品功能 不需要無菌操作 培養簡單 在24個月內保證穩定的芽孢數 根據標簽的化 學指示劑變化 可確認是否滅菌完全 經24小時 48小時或4天培養 可確認滅菌效果 并且信賴度高 使用方法 a 將生物指示劑管放入標準檢測包的中心 置于滅菌器的規定位置 b 按規定的滅菌溫度和時間進行滅菌處理 c 滅菌結束即刻將指示劑管取出 蓋朝上垂直握于手中 用鑷子夾住指示管 下端尖部 將管內甌夾碎 讓培養液流出 浸沒菌片 充分振搖 然后將置于56 培養箱 內或配套的微型培養器內 同時放一支未經滅菌處理的生物指示管作為陽性對照 一并培 養48小時 觀察結果 結果判定 培養后當生物指示劑管內培養液由紫色變為黃色 即表示有菌生長 判定滅 菌不合格 如仍為紫色即表示無菌生長 同時陽性對照生長正常 判定為滅菌合格 注意事項 1 生物指示劑管從壓力蒸汽滅菌器內取出后需在室溫下放10min左右 再將安 甌夾碎 2 未用完的生物指示劑隨時放入4 冰箱內 3 本生物指示劑在4 條件下存儲 4 2 生物指示劑實驗步驟 1 選用嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stereatherno philus 測定生物指示 劑的D值 1 8 2 將驗證用生物指示劑接種入被驗證產品的包裝容器中 如圖2 裝有 生物指示劑的容器要緊挨于裝有測溫探頭的容器 在滅菌設備的最 冷點 處 必須放置生物指示劑 樣品總數為20只 圖2 濕熱滅菌工藝驗證 第 13 頁 共 25 頁 圖3 圖4 3 驗證時 按產品設定的滅菌程序運行 滅菌后樣品經過濾處理后56 培 養48h 計數 共進行3次試驗 溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養基 圖3為滅菌后將安甌夾碎 圖4為將生物指示劑培養液放入56 培養箱內培養48小時 接種量計算 根據SLR F0 D bi 8 1 8 4 44 SLR lgA lgB B 2 303 lg 20 19 0 0513計算得A 10 3 153 15 CFU 瓶 即生物指示劑每包裝的接種量約為1 5 103 3CFU 瓶 4 3 實驗結果 D值驗證結果 滅菌方法微生物溫度 介質或樣品D 值 min 蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌1055 葡萄糖水溶液87 8 蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌1215 葡萄糖水溶液2 4 蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌121生理鹽水3 0 蒸氣滅菌產芽胞梭狀芽孢桿菌1055 葡萄糖水溶液1 3 測定F0值 t 1 min 時間 min 012345678 38 溫度 100102104106108110112114115 時間 min 3940414243444546 濕熱滅菌工藝驗證 第 14 頁 共 25 頁 溫度 114112110108106104102100 F0 1 10 100 121 10 10 102 121 10 10 104 121 10 10 100 121 10 8 41 min 規定F0 8合格 8 41 8 因此該滅菌柜符合標準 4 4 驗證合格標準 在設定的F0 條件下 121 30min30min滅菌后產品的污染概率低于10 6 6 20只 生物指示劑均應呈陰性 陽性對照組應明顯長菌 否則 驗證試驗無效 3次試 驗結果應一致 否則應分析原因或重作 4 5 結果分析及評價 生物指示劑編號 培養結果 1234567891011121314151617181920 第1次 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 第2次 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 第3次 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 陰 性 2