1、化學生物學綜合實驗六,指導教師：馬林 化學與化學工程學院,酪氨酸酶抑制及激活作用動力學的分析,一、實驗基本原理,酪氨酸酶(Tyraseosinase，Tyrase)又稱兒茶酚氧化酶(Ec.1.14.18.1)屬于多酚氧化酶（漆酶和二酚氧化酶）中的一種。它廣泛存在于紅薯、香蕉、蘋果、蘑菇、馬鈴薯及人體等動植物中，也存在于微生物，特別是霉菌之中。,在動植物體內，酪氨酸酶對酪氨酸和其它酚類化合物的代謝以及黑色素的合成起重要的催化作用。酪氨酸酶可以催化兩類不同的反應：單酚羥基化形成鄰二酚和鄰苯二酚氧化成鄰醌，這兩類反應都必須有氧分子的直接參與。,黑色素形成機制,對黑色素細胞內的黑色素形成機理的研究表明

2、，黑色素的形成主要是由黑色素細胞內的四種酶：酪氨酸酶多巴異構酶、過氧化物酶、等酶單獨或協同作用的結果。 大量的研究表明，黑素細胞內黑色素的生物合成是一個由酪氨酸酶催化體內酪氨酸羥化而啟動的一系列生化反應：體內酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羥基苯丙氨酸即多巴，多巴進一步氧化生成多巴醌，多巴醌經多聚化反應與氧化反應生成多巴色素，在多巴色素異構酶 作用下, 多巴色素羥化為5,6-二羥基吲哚羧酸, 脫羧成 5,6-二羥基吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后與其它中間產物結合形成真黑色素。脫黑色素的形成其前部分-由酪氨酸到多巴醌與真黑色素一致, 但在以后的反應中有半胱氨酸參加

3、, 產生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通過關環脫羧, 最后形成脫黑色素。,酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的關鍵酶，它不僅決定黑素合成的速率,還是黑素細胞分化成熟的特征性標志，因此它給人體皮膚美白帶來困難。酪氨酸酶的活性與黑素合成量相關，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪氨酸酶的抑制，對防止水果、蔬菜的褐變，化妝品中的皮膚增白，以及因酪氨酸酶催化產生黑色素引起的疾病（黃褐斑、黑色素瘤等色素沉著性皮膚病等），具有非常重要的治療意義。 酪氨酸酶的底物結合部位，由于銅原子與氧的結合部位關系密切，故凡能與銅原子形成復合物的化學試劑均有可能是酶的有效抑制劑。苯甲酸、疊氮化物、氰化物、苯硫脲和半胱氨

4、酸等對O2與酶結合有競爭作用；非酚類芳香族化合物對底物與酶結合有競爭作用。近些年來，人們從植物中分離出多種酪氨酸酶抑制劑用于化妝品工業，如熊果苷、曲酸、根皮素等。,二、實驗過程,酶抑制劑的高通量篩選可以通過酶標儀進行，但系統地、準確地研究抑制劑的IC50以及抑制作用的動力學必須通過精密儀器進行檢測。 本實驗將利用紫外-可見分光光度計測試幾種化合物對馬鈴薯多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制和激活作用的動力學。,實驗材料： 馬鈴薯酪氨酸酶粗酶（前面實驗提取） 抑制劑：硫酸亞鐵、六羥基二苯甲酮、2-萘酚 激活劑：1-萘酚、硫酸銅、二羥基二苯甲酮,實驗儀器和條件,北京普析通用UV-1901 紫外可見分光光度

5、計,實驗條件： 緩沖液：0.1mol/LpH 6.8磷酸鹽緩沖液。 底物：25mol/L 鄰苯二酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羥基二苯甲酮用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羥基二苯甲酮用乙醇配成10mol/L。 硫酸亞鐵和硫酸銅用蒸餾水配成50mol/L。,實驗安排,1，酶催化條件探索 由于每次實驗得到的粗酶液酶催化活性不同，所以在測試過程中，需要探索實驗中所使用的酶的劑量。 本實驗要求測試的酶催化活性-每分鐘OD值變化在0.1-0.13范圍內。本實驗采用調節酶液用量的方式。,2，測試體系 在總計1000L的測試體系中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸鹽緩沖液

6、，10L樣品溶液（以10 L緩沖液或乙醇做對照），10-20L粗酶液，室溫放置20分鐘，立即加入50L 25mol/L 鄰苯二酚溶液， 390nm進行時間掃描，記錄1分鐘的OD值。,實驗安排,3，抑制劑IC50的測試 改變樣品溶液的劑量，分別測試酶催化活性。可以通過稀釋的方式改變樣品的濃度。 以沒有加入樣品的酶催化活性OD/min值為100%，用抑制百分數(指被抑制而失去活力的百分數)表示不同濃度樣品對酶的抑制活性，作圖求出抑制50%時樣品的濃度。,實驗安排,4，抑制劑動力學的測試 適當選擇2個不同的樣品濃度，以及沒加樣品三個系列，改變底物溶液的劑量，分別測試酶催化活性。 以底物濃度（mol/

7、L）倒數1/S對酶催化活性OD/min值的倒數1/V作圖，根據三條線的交點判斷抑制劑的類型。,實驗安排,5，激活作用的測試 改變樣品溶液的劑量，分別測試酶催化活性。可以通過稀釋的方式改變樣品的濃度。 以沒有加入樣品的酶催化活性OD/min值為100%，用激活百分數(指被激活而增加活力的百分數)表示不同濃度樣品對酶的激活活性，作圖求出最大激活活性時樣品的濃度。,實驗安排,6，激活劑動力學的測試 適當選擇2個不同的樣品濃度，以及沒加樣品三個系列，改變底物溶液的劑量，分別測試酶催化活性。 以底物濃度（mol/L）倒數1/S對酶催化活性OD/min值的倒數1/V作圖，根據三條線的交點判斷抑制劑的類型。,三、實驗報告,兩名學生只對自己所做的實驗過程和結果進行分析，按照研究論文形式寫出實驗