酶法合成硫酸軟骨素和肝素糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)是一類以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖(N-乙酰氨基半乳糖)為二糖單位組合而成的聚合物并經硫酸化、變構化修飾而成的酸性、直鏈多糖,廣泛存在于動物細胞表面和周圍基質中。糖胺聚糖具有多種生物學功能包括調節細胞生長、增殖和分化等,被開發成一系列的化妝品、醫美和醫藥產品,其中硫酸軟骨素是一種治療骨關節炎的藥物,抗凝血藥。目前硫酸軟骨素和肝素主要從動物組織中提取,需消耗大量的酸堿,而且該方法制備的硫酸軟骨素和肝素中含有大量的其他糖胺聚糖,不僅降低它們的藥效甚至危及生命。因此,合成結構單一的硫酸軟骨素和肝素勢在必行,對它們的臨床應用和新功能的開發尤為重要。本文采用酶法催化軟骨素和肝素前體合成單一的硫酸軟骨素和肝素。在此過程中,硫酸化所需的硫酸化修飾系統和硫酸基供體3?-磷酸腺苷-5?-磷酸硫酸(3?-phosphoadenosine-5?-phosphosulfate,PAPS)再生系統尤為重要。本論文通過在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達鼠源酰基磺酸轉移酶(ArylsulfotransferaseIV,ASSTIV),構建PAPS再生系統；通過在畢赤酵母Pichiapastoris此基礎上，PAPSS生系統及硫酸化修飾系統合成硫酸軟骨素和肝素。主要研究結果如下：(1)優化ASSTIV表達構建PAPS高效再生系統。分別以pET20bpColdIIIE.coliBL21ASSTIV,SDS-PAGpColdIIIpET20bASSTIV的表達。為了純化及突變方便,10ASSTIV,YebF,CexPelB3ASSTIV的分泌表達,PelB的分泌能力最強,胞外上清的酶活達到0.36±0.01U/mL。為了提高E.coliBL21對ASSTIV的分泌能力PelBC-端進行隨機突變ASSTM(AGA酶活達到1.49±0.02U/mL。在酶分子水平，ASSTIV的底物結合口袋門控序列85-Val-Pro-Ser-Gly-Leu-Glu-Thr-Leu-Glu-Glu-Thr-95,L89S/E90L。進一步對以上兩個位點進行單點飽和突變和組合突變得到突變株L89M/E90Q的比酶活為5.98?0.15U/mg,是出發菌株的1.76倍,K<sub>catv/sub>/K<sub>mv/sub>相較于原酶提高了12.5倍。(2)表達硫酸轉移酶和差向異構酶構建硫酸化修飾系統。首先,比較在E.coli和P.pastoris等宿主中表達哺乳動物源硫酸轉移酶和差向異構酶的差異性以選擇合適的表達宿主。E.coli中,T7，SDS-PAGN--N-N-Deacetylase-N-sulfotransferase,NDSTC5epimerase,C5epi-4-硫酸轉移酶(Chondroitin-4-sulfotransferase,C4ST)和軟骨素-6-硫酸轉移酶(Chondroitin-6-sulfotransferase,C6ST)未表達;肝素-2-羥基硫酸轉移酶Heparansulfate2-O-sulfotransferase,HS2ST-6-Heparansulfate6-O-sulfotransferase,HS6ST-3-(Heparansulfate3-O-sulfotransferase,HS3ST)以包涵體形式表達。在上述蛋白的N-端融合麥芽糖融合蛋白(Maltosebindingprotein,MBP )后,NDST和C5epi以包涵體的形式表達；HS2ST實現可溶表達;C4ST和依舊沒有表達。P.pastoris中AOX為啟動子，HS3STC4STC6ST得以成功表達并分泌到胞外，C5epi實現胞內表達其余包括NDSTHS2ST和HS6ST沒有表達。在MBP后,NDSTC5epi、HS2STHS6ST實現分泌表達。HS2STHS6STSNMBP和硫氧還蛋白(Thiredoxin,TrxA)后,HS2ST和HS6ST3)利用軟骨素硫酸轉移酶催化軟骨素合成硫酸軟骨素。P.pastorisC4ST和C6ST0.101?0.001U/L0.100?0.002U/L,0.30?0.01U/mg和0.20?0.01U/mg此外，體外酶法催化能提高動物源硫酸軟骨素的硫酸化度，C4ST催化能提高硫酸軟骨素中GlcUA-GalNAc(4S)比例,C6ST催化能提高硫酸軟骨素中GlcUA-GalNAc(6S)比例。C4STC6ST37^oC48h,得到的產物LC-IT-TOF-MS紅外及核磁共振鑒定，C4ST催化軟骨素合成硫酸軟A,C6STC素。(4)利用肝素硫酸化修飾系統催化肝素前體合成肝素。 P.pastoris表達的NDST同時具有脫乙酰化酶酶活和N-硫酸轉移酶酶活,N-硫酸轉移酶酶活比E.coliNDSTN-24.46倍0.52?0.01U/mL。此外C5epi、HS2STHS6STHS3ST勺酶活分別為3.28?0.07U/L、5.33?0.22U/L,4.50?0.13U/L12.50?0.43U/L,E.coliC5epi、HS2STHS6ST及HS3ST的酶活高。利用重組P.pastoris表達的HS2STHS6STHS3ST148%189?17IU/mg在此基礎上