破裂型椎間盤突出動物模型中自身免疫反應的實驗研究

腰椎突出（ldh）是骨科常見病和常見病，主要表現為腰痛、下肢隱痛、坐骨神經痛，嚴重影響了患者的家庭和工作能力。過去髓核對神經根造成機械壓迫是LDH的主要發病機制這一觀點曾得到大多數人的認同,但自從動物實驗發現當腰椎間盤纖維環破裂時,即使沒有髓核壓迫神經根也會造成后者的損傷以后,人們在越來越多的動物及臨床研究中發現髓核引起的LDH患者異常的自身免疫反應在其發病機制中有著重要影響。因而本實驗應用大鼠建立一種破裂型椎間盤突出動物模型,通過自身免疫相關指標的觀察來進一步驗證上述觀點。1材料和方法1.1實驗動物和儀器健康成年SD大鼠20只(雄性,10月齡,體重250~300g,由湖北省動物實驗中心提供)。隨機分為兩組:對照組(n=10)和實驗組(n=10)。動物單獨飼養、充足食物和水,在12∶12h晝夜循環條件下飼養。1.2試劑與儀器大鼠免疫球蛋白IgG、IgM檢測試劑盒(浙江伊利康生物技術有限公司);S-P超敏免疫組化染色試劑盒(大鼠);生物素化羊抗大鼠IgG;二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(福州邁新生物技術開發公司)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(深圳晶美公司);白介素12(IL-12)試劑盒、IL-6試劑盒(BenderMedsystems公司);磷脂酶A2(PLA2)檢測試劑盒(CaymanChemical公司,美國);二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(普利萊基因技術有限公司,中國);SpectraMR分光光度儀(DynexTechnologies,美國)。全自動生化分析儀(日本Olympus)。酶聯免疫檢測儀(E2500型,美國BioRad)。SCR20BA型高速離心機(HITACHI公司,日本)。1.3大鼠坐骨神經的固定1%氯胺酮50mg/kg腹腔麻醉,消毒后距鼠尾根部1cm處切下鼠尾并縫合傷口。于鼠尾中取7~8個尾椎髓核備用。大鼠俯臥位固定于鼠板上,劈開臀大肌切口(左,右側均可),顯露坐骨神經三根分叉部近端部分,以自體髓核輕輕置于坐骨神經旁,使其接觸但并不壓迫,用彈性硅膠袖套環繞該段坐骨神經,并以縫線固定于神經周圍肌肉層上,以此保證髓核接觸坐骨神經而不會脫落。切口沖洗后以4-0絲線分2層縫合。放回鼠籠飼養。對照組不放置自體髓核,其余手術步驟一致。1.4大運動觀察觀察大鼠有無煩躁、撕咬肢體、運動功能障礙、后肢或足突然自發抬起、反復舔后爪、飲食變化,有無大小便失禁等情況。1.5機械縮嘴唇閾值檢測采用爬坡試驗檢測大鼠后肢運動能力,采用血壓計聯合注射器針刺刺激大鼠后爪的方法檢測其后肢機械縮爪閾值,用以評估動物痛覺過敏的程度。測定時間為模型建立前一天,模型建立后的1、2及3周(處死前)。1.6血清igg、igm含量檢測模型建立后第21天將大鼠處死后自心臟采血獲得血液約8ml,以干燥試管采集,離心分離血清,用大鼠透射比濁法試劑盒在全自動生化分析儀上檢測血清中IgG、IgM含量。1.7保存待檢液樣品同上法采取血樣置于EDTA抗凝管中,在15min內離心,1000r/min,收集上清液封閉于Ep管內-80℃冰箱保存待檢。按酶聯免疫吸附法(ELISA)操作方法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-12的含量。1.8體內輸注苯巴比妥鈉大鼠腹腔麻醉后,沿原手術切口分離臀大肌,找到坐骨神經中以硅膠袖套固定的節段,拆除袖套,分離局部肉芽組織,顯露移植髓核(對照組大鼠切取尾椎髓核為對照),切取該段坐骨神經,分別置入單獨的容器,置于-70℃下保存,麻醉動物經心內注射苯巴比妥鈉(100mg/kg)處死。1.9大鼠igg的檢測采用免疫組化LSAB(SP)法:標本石蠟包埋,4μm厚度連續切片,脫蠟,水化;消除內源性過氧化物酶;抗原修復;封閉;生物素化的羊抗大鼠IgG(作為二抗加入,一抗為抗原抗體復合物中的IgG),4℃過夜。滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(SP)溶液,37℃下30min,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明,中性樹膠封片。染色結果判斷,陽性為淺黃色,棕黃色或棕褐色,陽性沉積物存在于大鼠髓核軟骨樣細胞周圍的軟骨陷窩中,用PBS代替生物素化的羊抗大鼠IgG作為陰性對照。記錄各組標本中免疫組化染色抗原抗體復合物(IC)陽性例數。1.10免疫活性測定組織勻漿的制備:神經組織解凍,在500μl的裂解緩沖液中勻漿。裂解液配方:50mMTrisHClbase[pH7.5],150mMNaCl,6μg磺酞氟化二苯甲烷,6ng抑酞酶,6ng亮膚素,0.6ml0.1%諾乃洗滌劑P-40,0.3ml0.05%去氧膽酸鈉,加ddH2O容至5ml。0℃裂解30min。1200r/min,2℃下離心15min。取上清液-20℃保存。用于檢測PLA2活性和總蛋白含量。按PLA2活性檢測試劑盒操作說明書測定各標本PLA2活性(PLA2活性=△A414/min/10.66mM-1×0.225ml/0.01ml×樣本稀釋度)。按BCA法蛋白定量試劑盒操作說明書測定各標本中蛋白濃度。計算各標本的PLA2活性。1.11統計學處理采用SPSS11.5統計分析軟件,計量資料采取均數±標準差表示,兩獨立樣本組間比較采用t檢驗,計數資料采用確切概率法,P<0.05有統計學意義。2大鼠術后時間及外周血免疫情況觀察期間大鼠均未出現煩躁、撕咬肢體、后肢或足突然自發抬起、反復舔后爪以及飲食變化、大小便失禁等異常情況,也未出現明顯跛行甚至癱瘓的情況。實驗組大鼠均在術后48~72h出現坐骨神經痛的明顯癥狀,特征性癥狀為下肢出現強直性跖曲、外翻姿勢,足趾緊緊內收。無論休息還是行走時,動物不愿意用手術側后肢負重,常長時間處于抬高姿勢。這些變化導致步態的明顯異常,使手術側后肢站立期明顯縮短。這種改變在術后第7天達到高峰并持續至術后第21天處死。所有大鼠模型建立前爬坡試驗結果均為Ⅳ級,模型建立后,對照組爬坡試驗均為Ⅳ級,實驗組在模型建立后1、2及3周爬坡試驗均為Ⅲ級。建模前兩組大鼠后肢機械縮爪閾值差異無明顯統計學意義(P>0.05),建模后實驗組各時相點后肢機械縮爪閾值明顯降低,與建模前及對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)(表1)。實驗組大鼠外周血免疫球蛋白IgG、IgM含量均較對照組升高,差異有統計學意義(P<0.05);大鼠血清Th1型細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-12)含量較對照組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);實驗組大鼠移植髓核段坐骨神經中PLA2含量較對照組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。對照組大鼠髓核中無抗原抗體復合物沉積(圖1),實驗組有8只大鼠出現抗原抗體復合物沉積(圖2),與對照組相比有統計學意義(P<0.01)。3討論3.1自體髓核暴露于坐骨神經旁Naylor認為,胚胎時期即被纖維環包繞的髓核極有可能成為不能被自身免疫系統識別的“非己”成分,一旦暴露于免疫系統,即可導致免疫應答形成,在抗原部位(髓核及周圍組織)引發自身免疫反應,從而引發坐骨神經痛等臨床癥狀。隨后這一理論已在動物實驗上被證實。由于在臨床上LDH多以下肢放射性疼痛等坐骨神經痛為主要表現,本課題將大鼠自身髓核移植到坐骨神經旁,形成接觸而不壓迫,以此來探討自體髓核暴露于坐骨神經后是否會引發同樣的自身免疫異常。通過觀察發現造模后大鼠出現了明顯的步態異常,患肢站立期縮短,后肢機械縮爪閾值較前明顯降低等異常現象,提示該模型成功地模擬了臨床上LDH臨床表現中的痛覺過敏等現象,是一種很好的非機械壓迫性破裂型椎間盤突出動物模型。3.2th1型細胞因子與th2型細胞因子表達的差異由于細胞因子參與了自身免疫反應,尤其是在T細胞介導的自身免疫性疾病中起重要作用。根據Naylor提出的自身免疫說學理論,在突出的椎間盤組織中以Th1優勢狀態為主。Park等對40例腰椎間盤突出癥患者進行研究,采用ELISA法檢測突出椎間盤組織中Th1型細胞因子INF-γ、IL-12和Th2型細胞因子IL-4的表達,發現在破裂組中INF-γ、IL-12的表達明顯高于未破裂組;而后者突出椎間盤組織中IL-4的含量高于破裂組患者。本實驗結果顯示該模型外周血中TNF-α、IL-12較對照組明顯升高,驗證了由于作為自身免疫抗原的髓核組織暴露給機體的免疫系統后,激活了自身免疫反應,使得Th1型細胞因子(TNF-α、IL-12、IL-6)高度表達,促進了Thl細胞分化,Th1/Th2產生漂移,處于Th1優勢應答狀態,引起過度自身免疫性炎癥的發生,對坐骨神經造成病理損害,引發一系列臨床癥狀。3.3血漿高爾夫球場igg、igm的檢測目前許多研究均證實LDH患者或動物模型的髓核/血清中有高于正常水平的IgG、IgM存在。Spiliopoulou等研究發現LDH患者血清和腦脊液IgG和IgM均較正常人增高。事實上,作為椎間盤組織的自身抗體,IgG和IgM在血清中含量的升高正是說明了LDH機體中存在著異常的自身體液免疫反應。本研究結果顯示坐骨神經痛模型中血漿球蛋白IgG、IgM較正常組明顯升高,與上述文獻報道一致。筆者推測,由于椎間盤組織中的Ⅰ、Ⅱ型膠原以及糖蛋白等是潛在的自身抗原,它可激發機體由遲發超敏反應性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞介導的細胞免疫反應,導致椎間盤的早期退變,在T、B淋巴細胞和椎間盤抗原的不斷作用下,進而產生體液免疫反應,表現為血清中免疫球蛋白的升高。3.4關于髓核引發的自身免疫反應正常椎間盤組織中有少量IgG沉積,但無免疫復合物沉積。Satoh等采用免疫組織化學方法在突出椎間盤組織標本中發現了抗原抗體復合物沉積。國內劉志偉等對31例LDH患者突出的髓核組織進行免疫組化染色發現,其中所有的標本都可以發現抗原抗體免疫復合物的強陽性沉積,其中脫垂游離型標本中這種現象更為明顯。同樣的研究結果也出現在李青等的報道中。本課題組以往實驗也證明了免疫復合物沉積于自身抗原集中的部位(軟骨陷窩中),而且筆者推測這種沉積也與臨床分型呈正相關,即髓核暴露的越充分,其中免疫復合物的沉積就越明顯。如上文所述,髓核作為機體未曾識別的抗原,激活了免疫系統,引發了一系列異常的自身免疫反應,最終導致移植髓核接觸段的坐骨神經出現了明顯的病理損害和炎癥反應,主要體現在PLA2的活性上。這提示作為自身免疫反應的終末產物以及炎性反應的觸發因子,PLA2的大量表達將髓核引發的自身免疫反應轉化為具有明顯病理損害的炎性反應,引起坐骨神經的水腫,脫髓鞘化以及神經細胞